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产果胶酶黑曲霉的紫外诱变及其合成调节机制的蛋白质组学研究

林伟铃  
【摘要】:果胶酶是一种重要的工业用酶,广泛应用于果汁处理,纺织,造纸和饲料等工业。本文以一株果胶酶产生菌Aspergillus niger EIM-6为出发材料,通过反复紫外诱变处理,最终获得一株果胶酶高产菌株EIMU2。相较于野生型EIM-6,突变菌株EIMU2的形态和生长特征发生了明显的改变,主要表现为孢子色泽更黑,孢子团大,菌丝与孢子上凝结有更多的液珠;同时,菌丝更为粗壮,生长更快。经复筛后EIMU2酶活可达32161 U/mL,较原出发菌株的初始酶活14539 U/mL提高了1.212倍。进一步通过响应面法对EIMU2菌株的液体发酵培养条件进行优化。优化后的培养条件为甜菜渣1.83%,花生饼粉1.69%,(NH4)2SO4 0.5%,K2HPO4 0.3%,CaCO3 0.2%, MgSO4 0.15%(w/v),接种量6%(v/v),装液量21.36 mL。优化后的突变菌株产酶活性进一步提高至98794.3 U/mL,提高了2.07倍。 为了解释黑曲霉突变后果胶酶高产的产生机制,本实验进一步从酶蛋白表达总量的提高,酶基因自身的突变和多酶复合体系酶组分及其比例的变化这三个方面进行研究。在相同条件下接种培养野生株EIM-6与突变株EIMU2,发酵结束后分别提取它们胞外总蛋白,称重。对比发现突变株EIMU2的胞外总蛋白量较野生株EIM-6提高了14-17%。结果说明黑曲霉胞外酶蛋白表达总量的提高果胶酶高产的一个原因之一。对突变菌株EIMU2的胞外总蛋白进行蛋白双向电泳,鉴别该黑曲霉果胶酶复合体系的酶组分构成。通过2-DE凝胶蛋白斑点的质谱鉴定和数据检索,最终得到5个与果胶酶降解相关的蛋白点。这5个点包含了除原果胶酶以外的其它所有果胶酶组分:聚半乳糖醛酸酶X2、果胶酯酶和果胶裂解酶A,其中果胶裂解酶存在三个异构体。质谱分析结果中得到的果胶酶组分的等电点均处于pI4.0-6.0之间,这也与之前酸性果胶酶的结论相符合。分别从野生型EIM-6和突变菌株EIMU2中克隆果胶酶主要成分——果胶裂解酶和聚半乳糖醛酸酶的基因、测序分析,比对,发现二者的果胶裂解酶与聚半乳糖醛酸酶的基因完全一致,结果表明突变菌株果胶酶活性的提高不是来源于单一酶自身的基因突变。 进一步对提取的两株菌的胞外总蛋白(定量后取相同的蛋白量)进行差异蛋白质组学分析。从双向电泳图谱上可以看到4个有明显差别的蛋白点,突变株EIMU2的这4个蛋白点含量明显高于EIM-6,其余的蛋白质点具有明显的对应关系,表达量没有明显差异。挖取四个差异点进行质谱分析。质谱分析结果显示1号点为果胶酯酶,2号点为actibind蛋白,3号点为假设蛋白,4号点为线粒体DNA指导的RNA聚合酶。从质谱分析的结果可以看出,突变株果胶酶酶活的提高与果胶酯酶、actibind蛋白以及线粒体DNA指导的RNA聚合酶的表达量的提高有关,表明突变株EIMU2的果胶酶酶活的提高与黑曲霉的合成调节机制有关。我们的研究及将来进一步对相关蛋白的分析为下一步有针对性提高黑曲霉果胶酶产量提供了理论基础。


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