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PCL/PVA/pNSR32静电纺丝材料作为肌腱组织工程支架的研究

姚志攀  
【摘要】:聚己内酯(PCL)因具有良好的生物相容性、生物降解性、力学性能、药物通过性以及易加工等特点,并且该材料在体内降解之后的产物对机体没有毒害作用,已经广泛应用于组织工程生物材料领域。但由于PCL表面缺乏细胞亲和位点且降解速度较慢,因此,该材料在组织工程中应用还需对其进一步改性。 本实验室前期将蜘蛛拖丝蛋白基因转入到大肠杆菌原核表达体系,同时还引入与细胞粘附有关的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽编码序列,构建了工程菌pNSR32/BL21(DE3),通过高密度发酵、分离纯化获得32聚体的RGD-重组蛛丝蛋白pNSR32(分子量108kD)。由于表达产物蛋白质含有RGD三肽,使pNSR32具有促进细胞粘附和增殖的特点,可以有效改善PCL细胞亲和力的不足。 聚乙烯醇(PVA-124)是一种水溶性的高分子材料,具有较为良好的力学性能,作为一种医疗材料已加以应用。由于PVA-124具有一定的亲水性,可以改善PCL亲水性和降解速度慢的不足。 静电纺丝是近年来兴起的一种制备纳米纤维材料的技术,广泛应用于纺织、军事、电子和能源等领域,由于纳米纤维在形态上与细胞外基质(ECM)十分相似,因此静电纺丝技术在组织工程生物材料领域具有广泛的应用前景。本研究应用静电纺丝技术制备PCL/PVA/pNSR32纳米纤维材料,通过电子显微镜(SEM)观察电纺材料,研讨PCL和PVA的最适配比、pNSR32的含量以及电纺的最佳工艺参数;通过红外光谱(IR)分析这三种材料的共混形式;利用比重瓶法测定支架材料的孔隙率;同时还对材料的生物降解性、细胞相容性、组织相容性以及材料力学性能进行了评价。 结果:①在电压80kV、挤出速度5mL/h、固化距离20cm、温度45℃的条件下,在甲酸溶剂体系中PCL:PVA=2:1,添加5%RGD-重组蛛丝蛋白pNSR32,静电纺丝可获得纤维较为均匀的PCL/PVA/pNSR32纳米纤维材料。分析PVA、PCL和pNSR32在材料中以简单的物理形式共混;PCL/PVA和PCL/PVA/pNSR32的孔隙率高达90.2%和88.6%。 ②将PCL、PCL/PV PCL/PVA/pNSR32A、PCL/PVA/pNSR32三种电纺膜分别浸渍于含0.1%脂肪酶(w%)的PBS溶液(pH7.4),探讨三种材料的体外降解情况。结果表明:PCL/PVA、和PCL/PVA/pNSR32复合材料的降解速率明显优于PCL电纺材料,说明添加PVA能有效改善材料降解速率。 ③用PCL/PVA和PCL/PVA/pNSR32材料浸提液培养小鼠成纤维细胞NIH-3T3,根据生物材料细胞毒性反应分级标准,通过MTT法评价材料的细胞毒性。将细胞与处理过的PCL/PVA和PCL/PVA/pNSR32电纺膜材料共混培养,SEM和HE染色观察分析,MTT法检测细胞在材料上的增殖情况。结果表明:两种材料的细胞毒性均合格;细胞在PCL/PVA和PCL/PVA/pNSR32材料表面均可以粘附生长,但细胞在PCL/PVA/pNSR32表面的增殖情况要明显优于PCL/PVA表面,这是因为pNSR32中的RGD三肽序列能促进细胞的粘附和增殖。 ④将PCL/PVA/pNSR32、PCL/PVA电纺膜和医用胶原分别植入SD大鼠体内,术后3d、7d、14d和30d取材,石蜡切片,HE染色评价材料的组织相容性。结果显示,PCL/PVA/pNSR32复合支架材料可明显改善PCL/PVA的组织相容性,促进手术部位的愈合,有效降低材料周围的炎症反应,其效果与胶原相似。30d取材结果表明,PCL/PVA/pNSR32实验组的炎症细胞基本消失,大量的细胞聚集于材料,材料周围的组织反应与空白对照组相同,炎症反应Ⅰ级,伤口完全愈合。各组材料组织相容性的顺序为:胶原PCL/PVA/pNSR32PCL/PVA。认为PCL/PVA/pNSR32符合肌腱组织工程支架材料的组织相容性要求,有望成为一种新型的复合生物材料。 ⑤将PCL/PVA/pNSR32电纺膜卷成长棒状,利用马尾辫编织法将三股长棒状PCL/PVA/pNSR32材料制成人工肌腱(长30mm,直径约1.48mm)。通过测量人工肌腱和PCL/PVA/pNSR32膜的抗张强度和断裂伸长率,对其材料力学性能进行评价。结果表明:人工肌腱的抗张强度和断裂伸长率明显优于电纺膜,编织技术能有效提高材料的力学性能,PCL/PVA/pNSR32电纺材料有望作为一种肌腱组织工程支架材料。


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