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天然木质纤维素降解相关酶的宏蛋白质组学分析与鉴定

吕睿瑞  
【摘要】:天然木质纤维素的降解主要是在微生物菌群及其分泌的酶系的共同作用下完成的。因此,理解木质纤维素的降解机制应该是把木质纤维素的分解环境作为一个系统,分析参与木质纤维素降解的酶的成分与结构,而不是仅仅把某个微生物或者酶单独分离出来。收集来源于不同气候和植被类型的环境土壤样品,评价它们整体产酶水平以及木质纤维素降解能力,筛选木质纤维素降解能力优良的土壤样品。结果显示,土壤样品一般具有较高的初始木聚糖酶活,其中木聚糖酶活最高可达192.92 u/g,相反许多样品没有检测到明显的纤维素酶活。以天然木质纤维素材料为主要基质富集培养后,除个别样品酶活性稍有下降之外其余均明显提高,其中木聚糖酶活和纤维素酶活最高分别达到6530.99 u/g和1275.16 u/g。土壤HN-5的纤维素酶活和木聚糖酶活都比较高,同时对天然木质纤维素降解效率可达19.84%,是一个比较理想的研究木质纤维素降解机制的试验材料。 以一株来源于HN-5的具有比较高木质纤维素降解酶活的黑曲霉菌株HCB-3(Aspergillus niger)为出发菌株,初步建立木质纤维素降解酶的分析与蛋白质组学研究平台。黑曲霉菌株HCB-3(A.niger)是通过活性平板筛选从土壤样品HN-5中分离得到的一株具有较高木质纤维素降解酶活的真菌菌株。优化A.niger HCB-3发酵培养基后,提取发酵培养液中的胞外总蛋白进行蛋白质组学分析。通过二维凝胶电泳分离总蛋白,对凝胶上的蛋白点进行MOLDI-TOF-TOF串联质谱分析鉴定,最终鉴定出7个与半纤维素降解相关的酶。用Image Master 2D Platinum软件分析得到这7个酶的实际产酶比例。表明了蛋白组学平台在木质纤维素降解相关酶的鉴定与分析中的可行性。 在此基础上,富集培养和提取HN-5土壤的总蛋白。优化的HN-5土壤胞外可溶性总蛋白的富集和提取浓缩的最佳条件为:以天然的木质纤维素为基质在28℃培养10天,用0.5mol/1 pH6.0磷酸缓冲液浸提富集培养物,过滤离心获得上清,80%饱和硫酸铵沉淀,超滤除盐。将HN-5的胞外蛋白样品通过二维凝胶电泳分离各个蛋白点,对所有的可分辨点进行MODIL-TOF-TOF串联质谱鉴定,最终鉴定出5木质纤维素降解酶和葡聚糖降解酶,有过氧化氢酶、葡萄糖淀粉酶、葡聚糖1,4-α-葡萄糖苷酶、β-1,3-内切葡聚糖酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶,它们之间的比例约为5:30:20:40:10。我们的研究首次表明了真正参与天然木质纤维素降解过程中涉及酶的真实情况。随着研究的深入,一个完整的酶档案将为将来构建高效的木质纤维素降解复合酶系提供理论基础。


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