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CiP在毕赤酵母中的高效表达和纯化及部分酶学性质

陈飞  
【摘要】:灰盖鬼伞过氧化物酶是一种由担子菌类分泌的二型过氧化物酶,在工业废水处理和酶免疫反应等方面有广阔的应用前景。本实验成功在毕赤酵母中表达灰盖鬼伞过氧化物酶,且通过整合伴侣蛋白及5 L发酵罐条件优化进一步提高目的蛋白的表达,最后对目的蛋白进行了初步分离纯化和部分酶学性质研究,主要结论如下:1、成功在毕赤酵母X33中表达灰盖鬼伞过氧化物酶(Coprinus cinereus peroxidase, CiP)。摇瓶表达将分泌的胞外蛋白进行SDS-PAGE分析,目的条带进行质谱鉴定为CiP; 5L发酵罐下罐酶活达到867 U/mL,蛋白浓度2.1 g/L。将分子伴侣内质网氧化还原酶1(Erol)、二硫键异构酶(PDI)分别单独及同时整合进X33/pPIC9k-CIP中,单独整合Er01会降低CiP的表达,而单独整合PDI及同时整合Erol、PDI会提高CiP的表达,摇瓶中酶活较空白分别提高2.43、2.62倍,5L发酵罐下罐酶活分别提高1.94、3.90倍,比活分别提高1.21、1.46倍,同时整合Erol、PDI菌株下罐蛋白浓度4.4 g/L,酶活达到3379 U/mL。2、研究了共表达分子伴侣Erol-PDI的X33/pPIC9k-CIP高表达菌株的发酵过程,优化了其在5L发酵罐上的部分发酵工艺。实验结果表明诱导过程中以20:1(w/w)混合流加甲醇和山梨醇、诱导pH 6.0、诱导温度28℃为最佳条件,最终下罐蛋白浓度达到5g/L,且酶活达到3963 U/mL,较目前已报道的1200 U/mL已是最高水平。3、初步建立了CiP的分离纯化路线,即发酵液8000 r/min离心5min,10kDa分子量透析袋进行脱盐和Buffer置换,透析液利用Sephadex G25脱盐柱进一步脱盐、DEAE Sepharose Fast Flow离子柱离子交换层析,整个纯化过程酶活回收率为50%,经SDS-PAGE检测纯度较高,符合下一步酶学性质等实验的要求。CiP酶学性质方面,CiP最适反应pH为4.5,最适反应温度为25℃。


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