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灵芝全局性调控基因LaeA的克隆及其在灵芝酸生物合成过程中的差异表达

贺望兴  
【摘要】:灵芝是我国名贵中药,现代医学研究发现灵芝中的灵芝酸具有抗肿瘤和抗艾滋病毒等重要生物学功能。目前对灵芝酸的部分生物合成途径已有一定了解,发现灵芝酸的积累与灵芝孢子的形成息息相关。在丝状真菌中,全局性调控因子LaeA不仅能够调控菌丝分化,还对多种次级代谢基因簇的表达和次级代谢产物的产生起到重要的调节作用,因此推测LaeA基因在灵芝酸的合成过程中同样具有全局调控的功能。然而迄今为止,灵芝的LaeA基因尚未见报道。本实验利用灵芝较完整的表达序列标签(EST)数据库,以已知桔青霉(Penicillium citrinum)的LaeA蛋白质序列为模板,通过序列相似性搜索,序列拼接,序列验证和序列延伸等电子克隆手段获得灵芝LaeA的cDNA序列。经PCR和测序验证,该基因cDNA全长1137 bp,与其他真菌LaeA基因具有较高的同源性。在此cDNA的基础上,从灵芝基因组数据库定位获得LaeA完整基因,该基因包含7个外显子以及6个内含子,有真核基因启动子元件TATA盒、增强子结合区域CCAAT和GC框。采用生物信息学方法,借助电子计算机和相关的生物信息学软件,对该基因所编码蛋白从基本理化性质,疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜区结构、信号肽、二级结构、三级结构及进化关系等方面进行了预测和分析。该cDNA编码蛋白有378个氨基酸,相对分子质量为42895.3 Da,理论PI值为7.45,是一亲水性蛋白,存在于细胞质中。含有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合位点,并且含有典型的以SAM为底物的甲基转移酶超家族结构域,因此可以确定该LaeA蛋白行使甲基转移酶的功能。该蛋白与云芝、污叉丝孔菌等白腐担子菌类的亲缘关系较为亲近。为了进一步研究灵芝LaeA蛋白的性质,将LaeA基因与质粒pET32a连接,并转化到大肠杆菌中,成功构建了灵芝LaeA基因大肠杆菌异源表达体系,经IPTG诱导该基因在大肠杆菌中得到初步表达,为今后的蛋白纯化及蛋白性质研究奠定基础。振荡培养和液体静置培养是灵芝发酵生产灵芝酸的两种重要培养方式。本实验分别通过反相HPLC和荧光定量PCR法分析了灵芝在两种不同发酵过程中灵芝酸的产量和LaeA基因的表达差异。数据显示灵芝细胞在液体静置培养条件下灵芝酸的产量高于振荡培养方法,且灵芝酸的产量与LaeA基因的转录水平呈现正相关。灵芝全局性调控因子LaeA的发现为通过基因操作研究灵芝酸的生物合成调控机制奠定了基础。


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