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虾青素产生菌的筛选鉴定及其转化子的研究

江胜滔  
【摘要】:本课题从来源不同的腐叶土壤中分离出虾青素产生菌株J1、J2、J3、J4、 J5,通过真菌形态和发酵产物的鉴定,初步认为它们同属于红酵母。经过进 一步的筛选得到高产菌株J3,它的虾青素含量为397.0μg/gCDW。利用 18SrRNA分子技术,根据真核生物18SrDNA保守区段设计出两条引物: 18SF:5'CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA3’ 18SR:5'CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT3’ 经过PCR体系扩增出大小为1774bp18SDNA序列,其G+C含量为46.96%,在 Genebank中,进行比对分析,进一步确定该菌株J3是粘红酵母(Rhodotorulo glutinis),并命名为粘红酵母SJ。 通过电转化技术,以2.0kV、25μF、200Ω作脉冲转化的条件下,将雨 生红球藻的基因组DNA导入粘红酵母SJ中,并以二苯胺,硫酸铜为筛选 模型,获得了色素含量772μg/gCDW的转化子,是亲本粘红酵母SJ色素含 量的1.95倍。应用微生物形态学和RAPD技术,对转化子的遗传背景进行 鉴定。形态学方面,对雨生红球藻,粘红酵母SJ和粘红酵母SJ转化子三者 进行菌落形态的比较;分子生物学方面,优化了PCR的反应体系,反应条 件,从23条随机引物中筛选出1条引物(S168)。经过对三份供试材料的 RAPD分析,用引物S168在转化子中扩增出了双亲互补代谱,即在转化子 中既有雨生红球藻DNA,也有粘红酵母JS的DNA。结果证实了获得的转 化子整合有雨生红球藻基因组DNA;利用分光光度法,在波长为474nm光 下测定转化子与其亲本的虾青素含量,结果显示转化子的生物量最高,色素 含量高于粘红酵母SJ但低于雨生红球藻。 为了证实转化子产量稳定性,进行了连续八代产量稳定性试验。结果表 明:第4代最高,第1代最低,两者生物量相差4.83%、色素含量相差1.31 %、色素产量相差6.25%,转化子遗传是相对稳定的。以上转化子的生物量 是1.52g/100ml,比亲本雨生红球藻的生物量提高54.3倍,生长周期比亲本 雨生红球藻缩短12天,活性多糖含量为140.35 me,/100mI_,,比亲本粘红酵 母SJ提高了10.3%、同时还富含B族维生素、麦角固醇和蛋白质等其他活 性物质。


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