hBMP-7在毕赤酵母中高效表达及二聚体化研究

【摘要】： 骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)属于TGF-β家族的一类蛋白质生长因子，其中hBMP-7(又称OP-1)，除了具有常位／异位诱导骨形成的作用以外，在发育过程中还能对多种组织器官的发生、发育起到重要的调节作用。因此，hBMP7在阐明多种组织器官的发生、发育分子机制的研究及在临床上具有广泛的应用前景。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年发展起来并被广泛运用的一种优良的真核表达系统。本研究利用此表达系统表达hBMP-7，探讨在此表达系统中提高hBMP-7基因的拷贝数能否提高hBMP-7表达量，以及研究在此表达系统中表达高生物活性的hBMP-7二聚体蛋白的可行性。主要研究内容和结论如下：1、改造hBMP-7成熟肽的密码子，将酵母使用频率较低的密码子突变为使用频率较高的密码子，然后在hBMP-7成熟肽的N端带上a-factor的前-前导肽，接着构建表达载体pAO815-a-factor-BMP7m-1c(1拷贝)，在此基础上，构建多拷贝hBMP-7成熟肽的表达质粒。将表达质粒转化GS115菌株，并进行摇瓶表达目的蛋白的实验，取上清经DOT-BLOT快速半定量检测，初步的实验结果表明，随着hBMP-7成熟肽基因拷贝数的增加，hBMP-7成熟肽在酵母中的表达量也增多。2、把hBMP-7中FURIN识别的序列-RSIR-，应用SOEPCR的方法进行定点突变，改为酵母的Kex2p识别的序列-KR-，接着构建pPIC9K-BMP-7pmk表达载体。表达载体转化GS115菌株后，进行摇瓶培养表达目的蛋白的实验，表达产物经DOT-BLOT和WESTERN-BLOT分析，初步的实验结果表明，表达产物中无hBMP-7二聚体蛋白，说明用这种方法在酵母表达系统中无法获得hBMP-7二聚体蛋白。3、利用pfuDNA聚合酶将hBMP-7的前导肽与成熟肽的基因扩增出来，构建表达载体pPIC9K-BMP-7pm；构建表达载体pAO815-Furin；接着将两种质粒共转化GS115菌株，筛选出同时含有这两种基因的菌株，为研究这两种蛋白同时在GS115菌株中表达打下基础。