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罗伦隐球酵母B40脂肪酶的分离纯化及扩展青霉脂肪酶突变体的构建

王彩梅  
【摘要】: 本论文阐述了对罗伦隐球酵母B40(Cryptococcus laurentii B40)的发酵配方改良、该菌产生的脂肪酶的纯化及酶学特性等方面的研究。通过对发酵培养基的优化,确定了其适宜的发酵配方;通过硫酸铵沉淀、DEAE Sephadex A-25离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析等纯化步骤,对其发酵液进行了纯化,得到了电泳纯脂肪酶;通过SDS-PAGE初步确定其表观分子量约为21 KD。并对其作用温度和pH等酶学特性进行了研究。本论文还阐述了利用定点突变技术创建扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase,PEL)的随机突变体ep8与R182K的叠加突变体,其酶活与野生型PEL和随机突变体PEL-ep8相比都有所提高。 1.罗伦隐球酵母B40脂肪酶的分离纯化及特性分析 罗伦隐球酵母B40是一株可以分泌脂肪酶的酵母菌。作者设计了多种培养基配方对其发酵培养基进行优化。通过考查其菌体生长、发酵酶活及是否有利于分离纯化等指标。确定了菌体生长好、发酵酶活高并易于分离纯化的培养基配方:玉米粉0.5%,豆饼粉2%,(NH_4)_2SO_4 0.1%,Na_2HPO_4·12H_2O 0.2%,MgSO_4·7 H_2O0.25%,CaCl_2 0.01%,发酵培养基初始pH7.2。 通过硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-25离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析等步骤,作者从C.laurentii B40的发酵上清中纯化获得了电泳纯脂肪酶。该酶可在三丁酸甘油酯检验板上形成水解透明圈,其表观分子量约为21KD,是一种分子量较小的脂肪酶。该酶在35-45℃的范围内,有较高活性,其最适作用温度为43℃。在pH 9.2-12.2的范围内,酶的活性较高,其最适作用pH为pH10.7;在55℃以下,pH5.0-11.2的范围内,该酶有很好的稳定性。在所检测的金属离子中,多数对该酶酶活有抑制作用,尤其是Zn~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Al~(3+);表面活性剂0.05%Triton-100、0.5mM sodium Desoxycholate对该酶酶活有明显的促进作用,0.05%SDS、0.05%EDTA则对其有强烈的抑制作用。该酶对短链的脂肪酶具有偏爱性。作者还对该脂肪酶进行了N端序列的测定,但由于该脂肪酶的N端可能是封闭的,目前还未获得其N端氨基酸序列。 2.扩展青霉脂肪酶叠加突变体PEL-ep8-R182K的构建 利用重叠延伸PCR对扩展青霉脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,构建了R182K与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pA0815-ep8-R182K。将该质粒电转化引入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,进行异源表达。实验结果表明:该叠加突变体在毕赤酵母中获得了活性表达,得到表达产物脂肪酶PEL-ep8-R182K。在最适作用温度下,其比活为1461.3 U/mg,分别比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS(1407.07 U/mg)和野生型脂肪酶PEL-GS(1281.5 U/mg)提高了3.86%、14.03%。叠加突变脂肪酶PEL-ep8-R182K-GS的最适作用温度为40℃,与野生型脂肪酶PEL-GS和随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS的一致;其Tm值为38.71℃,与野生型脂肪酶PEL-GS(38.81℃)的相似,比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS(40.96℃)下降了2.25℃。


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