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microRNA对多巴胺能神经元分化的调节

何诗怡  
【摘要】:帕金森氏病(Parkinson's disease, PD)主要是因位于中脑“黑质”部位的细胞发生病理性改变后中脑黑质多巴胺能神经元(dopaminergic neuron, DA neuron)缓慢发生选择性死亡或纹状体多巴胺含量显著减少引起的。由于PD发生的根本原因是多巴胺能神经元数量的剧减导致其释放的DA递质含量不足,因此,对DA神经元分化的调控研究具有潜在的医学研究意义和临床应用价值。 Nr4a2/Nurrl是超家族转录因子的成员之一,它在腹侧中脑及中脑多巴胺神经元中高表达。已有研究报道Nr4a2/Nurrl (nuclear receptor-related factor1)是细胞核受体相关因子1,与多巴胺能神经元的发生具有密切联系,是决定多巴胺神经元的发育和分化的一个最重要的转录因子之一。目前,有文献报道micro RNAs(miRNAs)对多巴胺能神经元分化的转录子Nr4a2/Nurrl具有表达调控的作用。micro RNAs(miRNAs)是一类长度约为20-25nt的内源性单链非编码RNA,主要在转录后水平参与基因调控,在各种生命活动中起重要作用。因此,系统研究micro RNA对转录因子Nr4a2/Nurrl的调控作用,可以深入了解多巴胺神经元分化的机制,探索microRNA作为核酸调控分子在帕金森氏病发生发展中的作用。本文利用Dual-luciferase assays system,通过双荧光素酶报告基因的检测,初步筛选出对Nr4a2/Nurrl具有明显调控作用的miR-17、miR-183、miR-211、miR-106b、miR-20a、miR-19a和miR-206b。发现miR-17、miR-183、miR-211、miR-106b和miR-20a对靶基因NR4A2的抑制效果与对照组比较具有显著差异性(0.01P0.05)。 根据双荧光素酶报告基因的检测的结果,我们将有调控作用的miRNA和对照miRNA克隆到慢病毒lenti表达载体中。在体外将这些慢病毒载体通过磷酸钙转染法转染293T细胞,获得了表达miR-17、miR-183、miR-211、miR一106b、miR-19a、miR-20a和对照miRNA的病毒。 Western Blotting检测显示,与对照相比,过表达miR-17、miR-183、miR-106b的神经干细胞中靶基因Nr4a2的表达有明显的下降,而过表达miR-19a、miR-20a和miR-211的神经干细胞中,其靶基因Nr4a2的表达与对照相比无显著差异。 real-time-PCR分析显示,在过表达miR-17和miR-183的神经干细胞中,靶基因NR4A2在转录水平极显著下调(p0.01),过表达miR-106b的神经干细胞中Nr4a2/Nurrl的表达显著下调(p0.05),而miR-211则对靶基因NR4A2具有显著上调作用(p0.01)。 采用real-time-PCR检测胚胎干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化过程中miRNA对Nr4a2/Nurrl、TH、β-Tubulin基因的表达调控作用,结果表明:miR-17和miR-183通过下调靶基因Nr4a2/Nurrl的表达而影响多巴胺神经元标志基因TH和神经元标志基因β-Tubulin的表达。 通过上述研究,我们发现miR-17和miR-183通过调控转录因子Nr4a2/Nurrl的表达从而影响多巴胺神经元的产生,证实了miRNAs与帕金森氏病的发生是紧密联系的,这为帕金森氏病病的治愈及新药的研发提供了新思路。


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