XPD对SMMC-7721肝癌细胞中DNp73和GADD45β的调控及意义

【摘要】：目的： 通过将着色性干皮病D组基因(XPD， xeroderma pigmentosum group D)转染人SMMC-7721肝癌细胞后，观察XPD、GADD45β和DNp73基因mRNA和蛋白的表达变化；以及对人SMMC-7721肝癌细胞生长和凋亡的影响。 方法： 1、用含10%胎牛血清的1640培养液培养SMMC-7721肝癌细胞，并置于37℃、5%CO2的孵箱内培养。 2、通过Lipofectamine2000进行瞬时转染重组质粒pEGFP-N2-XPD、pEGFP-N2至SMMC-7721肝癌细胞内。实验分四组：XPD组、N2组、脂质体组和空白对照组，转染后在倒置荧光显微镜下观察转染结果。 3、设计并化学合成预检测基因的PCR引物：XPD、DNp73、GADD45β；收集各转染组及空白对照组SMMC-7721肝癌细胞，提取RNA并利用RT-PCR检测XPD、DNp73、GADD45β在各组细胞中的RNA表达水平；用Band Leader3.0图像分析软件进行灰度分析。 4、收集各转染组及空白对照组SMMC-7721肝癌细胞，提取蛋白并利用Western blotting检测XPD、DNp73、GADD45β在各组细胞中的蛋白表达水平；用Quantity One图像分析软件进行灰度分析。 5、利用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞的细胞增殖力。 6、利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率：四组细胞经0.25%胰酶消化后采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行流式细胞仪检测。 7、运用SPSS13.0进行分析，用均数±标准差表示资料，单因素方差分析用于组间比较，LSD检验用于两两比较。 结果： 1、转染：显微镜下见N2组和XPD组的细胞中有绿色荧光蛋白（GFP）的表达，然而空白组和脂质体组的细胞则未见表达。 2、RT-PCR检测： XPD组细胞内XPD和GADD45β的mRNA表达量均高于其他三组，而DNp73的mRNA表达量低于其他三组，差异有统计学意义(P0.01)。XPD、GADD45β和DNp73的mRNAs表达量在N2组、脂质体组和空白对照组之间差异无统计学意义(P0.05)。 3、Western blotting检测： XPD组细胞内XPD和GADD45β的蛋白表达量高于其他三组， DNp73的蛋白表达量低于其他三组，差异有统计学意义(P 0.01)。XPD、GADD45β和DNp73的蛋白表达水平在N2组、脂质体组和对照组之间差异无统计学意义(P0.05)。 4、MTT法检测细胞增殖活力：XPD组的细胞增殖力明显低于其他三组，差异有统计学意义(P 0.01)。 5、流式细胞仪检测细胞凋亡率：转染pEGFP-N2-XPD重组质粒的细胞凋亡较其他三组显著，凋亡达56.53%，差异有统计学意义(P0.01)。 结论： XPD具有抑制人肝癌细胞增殖和促进其凋亡的作用，其作用机制之一是通过抑制癌基因和促进抑癌基因的表达实现的。本研究发现癌基因DNp73随XPD的表达增加而减少，相反，抑癌基因GADD45β的表达随XPD的表达增加而增加；故推测两者在XPD基因抑制人肝癌细胞生长的调控过程中发挥重要作用。