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青钱柳多糖的分子修饰及其生物活性研究

谢建华  
【摘要】:青钱柳[Cyclocaryapaliurus (Batal.) Iljinskaja]系胡桃科青钱柳属,是我国特有的单种属乔木植物,目前已知其树叶具有抗氧化、抗凝血、免疫调节等生理功能。随着糖生物学研究的深入,包括硫酸化、羟甲基化、磷酸化等在内的分子修饰在多糖的研究中逐步成为热点内容之一。其中,硫酸化多糖由于其良好的抗氧化、抗病毒等活性,受到科研工作者的广泛关注。本文以江西修水青钱柳为原料,综合应用食品科学、有机化学、分析化学及现代仪器分析等技术与方法,对青钱柳多糖的提取精制、化学修饰、修饰产物的抗氧化性进行了研究,为丰富青钱柳多糖的应用提供一定的理论基础。主要研究内容与结果如下: 1.建立了基于苯酚-硫酸比色分析技术的青钱柳多糖含量的快速检测方法及基于微波消解联合ICP-AES法分析青钱柳多糖无机元素的方法。青钱柳用水提取,经多级处理除去脂类、单糖、双糖、低聚糖、氨基酸、蛋白质等杂质制得青钱柳精制多糖,采用精制多糖测得青钱柳多糖对葡萄糖的换算因子,建立了基于苯酚-硫酸法定量分析青钱柳多糖含量。结果表明,该方法快速、显色稳定、重现性好、平均回收率为98.20%,RSD为2.50%,适用于青钱柳多糖的含量测定,测得青钱柳多糖的平均含量为4.47%。采用微波消解联合ICP-AES法测定了青钱柳多糖中无机元素含量,结果表明该方法准确度高、重现性好、检测限为0.01-3.80mg/kg,平均回收率为94.3%~105.69%,RSD为1.01%~4.23%。样品中Na, Ca, Al, Mg, K, Fe, P, Zn, Mn, Cr, As, Cu, Pb和Se的平均含量分别为137.1±4.2,5980.0±102.7,885.3±25.6,1126.6±42.2,1810.5±30.5,633.0±21.8,2359.1±69.7,31.2±0.3,274.5±10.3,1.7±0.1,7.9±0.1,0.9±0.112.7±0.4,和17.7±0.2mg/kg,且Ca、Fe、Mg含量较高。在测定的18种元素中,青钱柳多糖由于Ni、Cd、V和Co等4种元素的含量低于检测限,而未能检出。 2.采用氯磺酸—吡啶法、乙酸酐法以及氢氧化钠-氯乙酸反应体系分别成功对青钱柳多糖进行硫酸化、乙酰化和羧甲基化修饰。青钱柳多糖使用热水浸提法自行提取,经过脱蛋白后得到青钱柳精制多糖。分别使用氯磺酸吡啶体积比为1:1,1:4,1:6,1:8制得四种不同取代度的硫酸化青钱柳多糖,分别命名为S-CP1-1,S-CP1-4,S-CP1-6和S-CP1-8。通过控制乙酸酐剂量,以乙酸酐法制得的青钱柳多糖乙酰化产物分别记为Ac-CP1、Ac-CP2和Ac-CP3;以及氯乙酸的量,分别在以制得的青钱柳多糖羧甲基产物CM-CP1、CM-CP2和CM-CP3。通过各种方法分析了其蛋白质、糖醛酸、取代度、分子量、单糖组成等理化性质,利用HPAEC-PAD离子色谱分析技术对青钱柳硫酸化多糖S-CP1-1,S-CP1-4,S-CP1-6和S-CP1-8,Ac-CP1、Ac-CP2和Ac-CP3,CM-CP1、CM-CP2和CM-CP3单糖组成进行分析,结果表明各修饰产物多糖单糖主要为阿拉伯糖,半乳糖,葡萄糖以及半乳糖醛酸。通过红外光谱、紫外光谱、圆二光谱等探索硫酸化、乙酰化和羧甲基化修饰对青钱柳多糖结构的影响,采用紫外光谱190-400nm范围内对修饰前后的青钱柳多糖进行扫描,未出现新的特征吸收,FTIR图谱显示这四种青钱柳多糖衍生物中均有相应的修饰基团,表明硫酸化、乙酰化和羧甲基化修饰都获得成功。 3.构建DPPH自由基体系,超氧阴离子自由基、Fenton反应产生的羟自由基及胡萝卜素/亚油酸体系等抗氧化体系,探索硫酸化修饰产物(S-CP1-1,S-CP1-4,S-CP1-6和S-CP1-8)、乙酰化修饰产物(Ac-CP1、Ac-CP2和Ac-CP3)和羧甲基化修饰产物(CM-CP1、CM-CP2和CM-CP3)的抗氧化性,并与未经修饰的青钱柳多糖抗氧化性进行比较。青钱柳硫酸化多糖S-CP1-1,S-CP1-4,S-CP1-6和S-CP1-8对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基等均有一定的清除作用。硫酸化后,同一浓度S-CP1-8和S-CP1-6对DPPH自由基、超氧阴离子自由基清除率高于青钱柳多糖,而S-CP1-1和S-CP1-4的清除率却低于青钱柳多糖,并且在其它抗氧化体系中也表现出不同的取代度的硫酸化修饰的自由基清除活性产生的效应存在很大的差异,并且与各抗氧化测试体系也有相关性。对青钱柳多糖进行适度硫酸酯化修饰可以显著增强该多糖对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除活性,过度硫酸酯化会造成该多糖对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除活性降低。表明对青钱柳多糖进行适度的硫酸化修饰才能使其抗氧化性得到显著提高。羧甲基化基团的引入影响了多糖的水溶性,羧甲基化修饰产物CM-CP1、CM-CP2和CM-CP3)的抗氧化性均低于原多糖。各硫酸化、乙酰化及羧甲基化修饰产物的抗氧化性均低于Vc。这些证明了化学基团的引入可能会增强多糖的活性、改变了多糖的生物活性。同时研究结果表明多糖的抗氧化活性和它的结构参数如取代度、分子量、其他取代基团的种类和位置等有关。由于青钱柳多糖的结构相当复杂,分子修饰后的多糖的理化特性、结构等也存在较大差异,而使多糖的抗氧化所产生的效果也各不相同。 4.以小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞为研究对象,探讨了青钱柳多糖及其修饰后产物对巨噬细胞功能的影响。结果发现,青钱柳多糖及其修饰后产物均能够显著促进巨噬细胞增殖,无细胞毒性;增强细胞吞噬功能;上调活性氧NO及细胞因子肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β的分泌,进一步利用PCR和Western blot技术从细胞因子mRNA水平、iNOS蛋白水平论证青钱柳多糖及其修饰后产物对细胞因子及活性氧的释放是在翻译、转录水平调控的。


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