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产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌MLST分型、耐药传播及致病机理的研究

魏丹丹  
【摘要】:目的:1.了解碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)产碳青霉烯酶的分布,探究其分子流行病学机制,为临床防治CRKP菌的感染提供科学依据。2.调查主流碳青霉烯类酶基因blaKPC-2的基因环境及其耐药传播的多态性,探究其分子传播机制。3.明确产KPC-2酶肺炎克雷伯菌的血清荚膜分型及毒力基因分布,筛选高毒力高耐药hvKP菌株。4.探究中性粒细胞凋亡在hvKP菌致病中发挥的作用。方法:1.收集南昌大学第一附属医院2012年1月-2012年6月各种临床标本中分离CRKP菌60株,结合改良Hodge试验、EDTA协同及增效试验与特异性聚合酶链反应(PCR)扩增检测碳青霉烯酶基因(VIM、IMP、NDM、KPC、OXA-48、SPM、GIM),接合试验定位耐药基因,PBRT质粒分型方法确定接合子质粒复制子分型,多位点序列分型(MLST)分析菌株之间的同源性。2.收集南昌大学第一附属医院2012年1月-2012年12月各种临床标本中分离产KPC-2酶肺炎克雷伯菌35株,采用PCR Mapping及测序拼接的方法分析blaKPC-2的基因环境,分析基因环境多态性与MLST分型及质粒复制子之间的相关性。3.收集南昌大学第一附属医院2012年1月-2013年6月各种临床标本中分离产KPC-2酶肺炎克雷伯菌56株,PCR及测序技术确定其血清荚膜分型及毒力基因携带,血清抗性、中性粒细胞抗吞噬试验及动物实验验证其体外毒力。4.应用流式细胞术检测体内外感染hvKP和non-hvKP菌后中性粒细胞的凋亡率、呼吸爆发产生的ROS水平变化,炎症因子(IL-1β,TNF-α)水平变化采用ELISA方法检测。结果1.改良Hodge试验和EDTA协同及增效试验筛选出18株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,PCR结果显示13株产KPC-2酶,5株产IMP-4酶,4株产NDM-1酶,1株产VIM-2酶,其中5株产IMP-4酶的菌株同时产KPC-2酶,主流碳青霉烯酶基因为KPC-2酶;所有菌株均携带PMQR相关基因、ARDs相关基因及β内酰胺酶相关基因;除IMP-4基因外,均可通过质粒接合试验进行碳青霉烯酶基因的传递,接合子分析发现blaKPC-2基因主要存在于~65 Kb L/M和~100 Kb A/C型质粒上,blaNDM-1基因主要存在于~70 Kb A/C型质粒上,blaVIM-2基因主要存在于~20 Kb一个不可分型的质粒上;18株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌被分为9个克隆株,主要集中于ST395和ST263中,呈现多克隆传播。2.35株产KPC-2酶肺炎克雷伯菌被分为15个克隆株,主要集中于ST11、ST263和ST395中,呈现多克隆传播;所有产KPC-2酶肺炎克雷伯菌可通过质粒接合试验进行blaKPC-2基因的传递,blaKPC-2基因分布于质粒大小在20-140Kb之间的多种复制子分型上,主要分布于~65 Kb L/M型质粒上;针对blaKPC-2基因周围环境的差异将本地区blaKPC-2基因环境共分为5种序列模式,分别为plaform i-v,其中platform i主要存在于CC14基因群中,主要包括ST14和ST15型,主要分布于A/C质粒上;而platform ii主要分布于ST23、ST101、ST263及ST700中,主要位于IncFII(K)质粒上;platform iii是本地区分布最广的blaKPC-2基因周围环境模式,其主要存在于CC11基因群中,主要包括ST11、ST258、ST340等基因型,多分布于L/M型质粒上,而platform iv主要存在于ST37、ST392、ST340基因型中,主要分布于N型复制子分型质粒上,platform v只存在于ST86型菌株中,质粒复制子分型为FIB型。3.56株产KPC-2酶肺炎克雷伯菌,主要血清型是wzi47-K47型,占66.1%(37/56),检出2株高毒力荚膜血清型,分别为K1型和K2型;检出1株高耐药hvKP菌株,且携带多种毒力基因,体外毒力试验显示具有较高的血清抗性及抗中性粒细胞吞噬能力,小鼠腹腔感染检测发现LD50(95%CI)为2.13×10~1(7.2×10~0~1.21×10~2),显著低于于non-hvKP菌的LD50(95%CI)3.52×10~7(2.5×10~6~4.15×10~7)(P0.05)。4.与对照组non-hvKP菌相比,体内外感染hvKP菌的中性粒细胞凋亡明显延迟,呼吸爆发明显减弱,促进细胞炎症因子IL-1β及TNF-α释放量显著增加(P0.05)。结论:碳青霉烯酶KPC-2的产生是肺炎克雷伯茵对碳青霉烯耐药的重要原因,且呈多克隆传播,KPC-2基因周围序列与MLST分型及质粒复制子分型有一定的相关性;存在高耐药KPC-hvKP菌株;中性粒细胞凋亡延迟可能在hvKP菌株致病中发挥作用。


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