柚皮苷逆转人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP耐药性及逆转机制的研究

【摘要】：目的:研究柚皮苷对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP体外增殖的影响及耐药逆转作用,并初步探讨相关耐药机制。方法:1、不同浓度的顺铂(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml)分别作用于SKOV3及SKOV3/DDP细胞,MTT法测48h后两种细胞的增殖抑制率,分别得出IC50,计算得出SKOV3/DDP的耐药指数。2、用不同浓度柚皮苷(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)作用于人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP,分别作用24h、48h、72h后,MTT法测定不同药物浓度组,作用不同时间后对SKOV3/DDP细胞的抑制率,筛选出非细胞毒性的柚皮苷浓度。3、非细胞毒性的柚皮苷联合不同浓度的顺铂(DDP)作用48h后,测定柚皮苷联合DDP对SKOV3/DDP细胞的增殖抑制率,计算出半数抑制浓度IC50,与单独DDP作用比较,以此判断柚皮苷能否增加耐药细胞对DDP的敏感性。4、不同实验组:空白对照组、单独柚皮苷组(10μmol/L)、单独DDP组(5μg/ml)、柚皮苷(10μmol/L)联合DDP(5μg/ml)组,上述分组作用48h后,采用RT-PCR法测定不同实验组SKOV3/DDP细胞内MDR1 mRNA及MRP2mRNA的表达;western blot法检测不同实验组SKOV3/DDP细胞内P-gp、MRP2蛋白的表达水平。结果:1、不同浓度的DDP处理SKOV3及SKOV3/DDP细胞48h后,SKOV3细胞的IC50为5.48μg/ml,SKOV3/DDP细胞的IC50为14.93μg/ml,耐药指数RI为2.72。2、柚皮苷作用于SKOV3/DDP细胞后的增殖抑制作用随着浓度的增高而增大,同一浓度作用下,抑制率随着时间的延长而增大。10μmol/L的柚皮苷作用于SKOV3/DDP细胞24h、48h、72h后的抑制率(%)分别为3.24±1.18、6.61±0.19、9.53±0.24,柚皮苷作用SKOV3/DDP细胞48h后,10%的细胞生长受抑制所需要的柚皮苷浓度IC10为12.66μmol/L。为避免实验过程中细胞死亡过多,后续试验选取10μmol/L柚皮苷作为实验用浓度。3、非细胞毒性的柚皮苷(10μmol/L)联合不同浓度的DDP作用48h后,计算得到SKOV3/DDP对DDP的IC50从14.93μg/ml降至8.87μg/ml,发现SKOV3/DDP对DDP的耐药指数明显降低,RI为1.62,单独DDP作用时RI为2.72,由此可得出非细胞毒性的柚皮苷能部分逆转SKOV3/DDP的耐药,其逆转倍数为1.68。4、SKOV3/DDP细胞中MDR1 mRNA、MRP2 mRNA的表达:与空白对照组比较,单独柚皮苷组(10μmol/L)、柚皮苷(10μmol/L)联合DDP(5μg/ml)组MDR1 mRNA、MRP2 m RNA的表达均降低,差异有统计学意义(P0.05),单独DDP组(5μg/ml)与空白对照组比较,差异无统计学意义(P0.05),柚皮苷(10μmol/L)联合DDP(5μg/ml)组与单独DDP组(5μg/ml)比较,MDR1 m RNA、MRP2 mRNA表达明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。5、SKOV3/DDP细胞中P-gp和MRP2蛋白的表达:单独柚皮苷组(10μmol/L)、柚皮苷(10μmol/L)联合DDP(5μg/ml)组分别与空白对照组比较,蛋白表达均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),单独DDP组(5μg/ml)与空白对照组比较,差异无统计学意义(P0.05),柚皮苷(10μmol/L)联合DDP(5μg/ml)组与单独DDP组(5μg/ml)比较P-gp、MRP2蛋白的表达均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:柚皮苷对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP的体外增殖具有明显抑制作用,并能增强SKOV3/DDP细胞对DDP的敏感性,其逆转耐药的机制可能与下调多药耐药基因MDR1及多药耐药相关蛋白(MRP2)基因的表达有关。