TRIM14通过调控HBP通路抑制非小细胞肺癌细胞生长

【摘要】：背景与目的:三重基序蛋白家族(tripartite motif,TRIMs)是一类含有RING结构域的E3泛素化连接酶,通常含有一个RING结构域,一个或者二个B-box和一个螺旋卷曲结构。已知的TRIMs家族蛋白主要功能是通过发挥E3泛素化连接酶的活性,调控细胞内的多个信号通路,参与细胞的分化、增殖、凋亡等,但许多TRIMs蛋白的生物学功能仍然不清楚。TRIM14则是一个不含RING结构域,但具有E3泛素化连接酶活性的成员。本文通过分析TRIM14在非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达,进一步探究TRIM14在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用及分子机制,为NSCLC的临床诊疗提供理论依据和新的方向。方法与结果:1.采用免疫组化和免疫印迹实验检测TRIM14在肺癌组织与癌旁组织中的表达。结果显示:TRIM14在非小细胞肺癌组织中的表达量较癌旁组织表达量明显降低。2.采用免疫印迹和实时荧光定量PCR检测TRIM14在不同NSCLC细胞中的表达。结果显示,TRIM14在A549细胞中表达量最高,而在H1299细胞中表达量较低。3.在NSCLC细胞H1299和A549中分别过表达及干扰TRIM14的表达后,进行细胞计数、细胞划痕、Transwell和克隆形成实验,观察TRIM14对细胞生长、迁移和集落形成的影响。结果表明,过表达TRIM14显著抑制H1299细胞的生长、迁移和克隆形成,干扰TRIM14的表达可促进A549细胞的生长、迁移和克隆形成。4.在H1299和A549细胞中分别过表达以及干扰TRIM14的表达后,采用免疫印迹法检测氨基己糖途径(HBP)相关蛋白的水平,如:O-GlcNAc、GFAT1。结果显示,过表达TRIM14可下调NSCLC细胞内GFAT1蛋白表达和O连接糖基化水平。5.在NSCLC细胞中过表达TRIM14后,用蛋白合成抑制剂亚胺环己酮(CHX)以及蛋白酶体抑制剂MG132处理不同时间,通过免疫印迹法检测O-GlcNAc和GFAT1蛋白水平的变化。结果表明,MG132可以阻断TRIM14对GFAT1的作用。6.在H1299细胞中过表达TRIM14,用不同浓度的HBP通路激动剂N-乙酰葡萄糖胺处理后,通过免疫印迹法检测O-GlcNAc的蛋白水平。结果显示,N-乙酰葡萄糖胺能恢复TRIM14引起的O连接糖基化水平的下降。结论:本研究表明,TRIM14在非小细胞肺癌组织中的表达量较癌旁组织低;TRIM14能够显著抑制NSCLC细胞的生长、迁移和克隆形成;TRIM14通过发挥其E3连接酶的作用,降解GFAT1从而下调NSCLC细胞的O连接糖基化水平。以上结果表明TRIM14可能是一个抑癌蛋白,通过降解HBP关键限速酶GFAT1调控NSCLC细胞的O连接糖基化水平,从而抑制NSCLC细胞的增殖和迁移。