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多种光谱学技术和计算机对接模拟研究多酚类物质对多酚氧化酶的抑制机理

熊志强  
【摘要】:多酚氧化酶(Polypheoloxidase,PPO)存在于许多有机体中,如植物、动物、真菌、细菌等。它能够将酚类化合物氧化生成邻苯二酚,邻苯二酚再进一步氧化生成邻醌,是酶促褐变的主要原因,严重地影响了食品尤其是果蔬在加工和储运过程中的品质。能否有效地抑制多酚氧化酶的活性,直接关系到食品加工与保藏后的品质优劣及其经济价值。因此,选用高效安全的抑制剂抑制酶的活性十分必要。本文采用紫外可见分光光度计、荧光光度计、圆二色谱仪、原子力显微镜和计算机对接模拟技术等,分别研究了三种不同的多酚类物质(龙胆酸、芹菜素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷)对PPO的抑制作用、抑制类型、抑制动力学、热力学性质、构象及微观形貌的影响,从分子水平上模拟并探讨多酚类物质与PPO的相互作用机理,为深入研究多酚类物质对PPO的抑制机理提供了理论参考。本文的主要内容如下:(1)简要介绍了多酚氧化酶的来源、结构、褐变机理等。综述了多酚氧化酶的研究现状,包括多酚氧化酶的抑制方法、抑制动力学、构象变化、微观形貌变化以及计算机对接模拟在多酚氧化酶研究中的应用。(2)采用龙胆酸、芹菜素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分别处理PPO,研究其对PPO酶学性质的影响。研究表明:随着龙胆酸、芹菜素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷浓度的增加,PPO的相对活性逐渐降低。龙胆酸、芹菜素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对PPO的半抑制浓度(IC_(50))分别为2.10?10~(-3)、3.92?10~(-5)、3.05?10~(-5)mol L~(-1)。抑制能力大小比较:矢车菊素-3-O-葡萄糖苷芹菜素龙胆酸;龙胆酸和肉桂酸分别与芹菜素混合处理PPO均表现出协同效应,其中肉桂酸和芹菜素混合产生的协同效应更强,而矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芹菜素混合后对PPO活性的抑制表现为加和或次加和效应;龙胆酸和芹菜素对PPO的抑制类型均为混合型可逆抑制,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对PPO的抑制类型为不可逆抑制。龙胆酸对PPO的K_i和α分别为3.10?10~(-4) mol L~(-1)、15.36,芹菜素对PPO的K_i和α分别为2.23?10~(-5) mol L~(-1)、1.33;不同浓度龙胆酸、芹菜素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分别与PPO混合后在不同温度下热处理后,PPO的热稳定性逐渐降低。(3)采用龙胆酸、芹菜素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分别处理PPO,研究其与PPO的相互作用机理。研究表明:龙胆酸、芹菜素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷均对PPO的内源荧光有很强的猝灭作用,PPO的三级结构发生了变化,其中龙胆酸处理PPO后其最大荧光发射峰发生红移。根据结合常数分析,发现龙胆酸和芹菜素在PPO上分别存在一个结合位点;龙胆酸、芹菜素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分别与PPO相互作用后,伴随着PPO的α-螺旋含量下降和β-折叠含量上升,PPO的二级结构发生了明显的变化;龙胆酸和芹菜素分别与PPO相互作用后,PPO分子基团的粗糙度、平均高度和平均宽度均变大,PPO的微观形貌发生了明显变化。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷与PPO相互作用后,PPO分子基团的粗糙度、平均高度和平均宽度几乎不变,PPO的微观形貌无明显变化;龙胆酸和芹菜素进入到了PPO的疏水空腔,与PPO周边的氨基酸残基发生相互作用,并通过氢键、pi-pi相互作用和范德华力等作用力使对接构象变得更加稳定;矢车菊素-3-O-葡萄糖苷可能与PPO活性位点上的Cys83之间形成了共价键,也可能是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的糖苷键断裂后与Met294中的S原子重新形成了稳定的共价键。


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