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人表皮干细胞lncRNA与mRNA差异表达相关性及其作为ceRNA的作用分析

刘洋  
【摘要】:目的:观察人表皮干细胞和已分化的角质形成细胞中lncRNA和mRNA的差异表达及其相关性,初步探索lncRNA作为竞争性内源性RNA(ceRNA)参与调控表皮干细胞的自我更新及分化,获得更多有关表皮干细胞体外复制、扩增和分化调控的新信息,为组织工程构建皮肤提供更理想的种子细胞来源,为未来创面愈合的基因治疗提供线索。方法:(1)取泌尿外科行包皮环切术患者的正常包皮组织,采用酶消化法和Ⅳ型胶原快速贴壁法获得A组人表皮干细胞、B组角质形成细胞。倒置显微镜下观察两组细胞的生长状况,免疫细胞化学染色法行β1整合素、CK1、CK10、CK19单抗检测鉴定。用Trizol一步法分别提取2组细胞总RNA并质检,纯化后进行荧光标记、芯片杂交,然后扫描得到杂交图片,利用软件提取数据并行差异性分析,同时应用RT-PCR法验证芯片结果的可靠性。对差异表达的蛋白编码基因行GO分析和Pathway分析。(2)结合以往文献报道,通过UCSC在线软件对本试验中表皮干细胞中差异表达Lnc RNA进行整合,归纳总结出差异表达的反义链型lncRNA、正义链型lncRNA、增强型lncRNA及基因间lncRNA。接着利用BLAST在线软件检测差异表达的外显子正义链型lncRNA和其邻近差异表达蛋白编码基因的碱基相似性,以寻找可能的竞争性内源性lncRNA,结果发现差异表达NR_073046和NR_045013分别与邻近蛋白编码基因序列高度相似,故借助靶基因预测软件Targetscan及miRanda分别对其可能结合的靶mi RNA进行预测,以进一步预测这两个lncRNA的竞争性结合机制。除此以外,计算4个异常表达的lncRNA和mRNA的皮尔森系数,以相关系数的绝对值大于0.99且P值小于0.001为阈值,寻找共表达lncRNA-mRNA对,并构建了lncRNA-mRNA共表达调控网络图,并对差异lncRNA靶基因进行了GO分析及Pathway分析,以更好地验证lncRNA与m RNA的相关性。结果:(1)快速黏附于Ⅳ型胶原的A组细胞培养3 d能形成明显克隆,免疫细胞化学染色显示β1整合素及CK19呈阳性表达,符合表皮干细胞特征;不能快速黏附于Ⅳ型胶原的B组细胞培养3 d无明显克隆形成,CK1及CK10呈阳性表达,符合角质形成细胞的特征。提取两组细胞总RNA质检合格后筛选出3720条lncRNA和4069条mRNA有差异性表达,其中2292条lncRNA明显上调,1428条lncRNA明显下调,1248条mRNA明显上调,2821条mRNA明显下调,RT-PCR验证结果与芯片检测结果具有较好的一致性,且GO分析条目涵盖增殖、生长、凋亡等条目。(2)对差异表达的lncRNA行亚类分析,发现其中有165条反义链型lncRNA,759条外显子正义链型lncRNA,293条增强型lncRNA以及768条基因间型lncRNA。紧接着对外显子正义链型lncRNA行碱基相似性分析发现15条lncRNA与邻近蛋白编码基因相似基序列达到90%以上,其中差异表达NR_073046和NR_045013分别与邻近蛋白编码基因DEDD2和LMO3的相似序列达到100%。进一步的靶miRNA预测,发现NR_073046可与DEDD2竞争性互补配对结合432条miRNA,其中有10条miRNA为高度互补配对且相对保守,比如miR-204-5P/211-5p,NR_045013可与LMO3竞争性互补配对结合960条miRNA,其中有62条miRNA是高度互补配对且相对保守,比如miR-200a-3p/141-3p,miR-489-3p,miR-199-5p,而且lncRNA-mRNA共表达分析表明NR_073046和NR_045013分别与DEDD2和LMO3的表达存在相关性。结论:(1)体外培养的人表皮干细胞与角质形成细胞lncRNA与mRNA表达谱存在明显差异,这可能与两者不同的增殖分化能力等生物学特性有关。(2)差异表达的NR_073046和NR_045013可能通过竞争性内源性机制结合miRNA,分别调控相应蛋白编码基因DEDD2和LMO3的表达,从而参与表皮干细胞的自我更新及分化,为创面愈合的治疗提供了新的理论基础。


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