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RACK1调控NF-κB信号通路在幽门螺杆菌感染致癌中的作用及机制

胡奕  
【摘要】:背景与目的:最新的全球癌症流行病学数据表明胃癌位于全球肿瘤发病率与死亡率的第五位及第三位。我国是胃癌发病大国,全球每年新发的胃癌患者中,半数以上来自中国。晚期胃癌患者的预后差,缺乏有效的治疗方法。因此,阐明胃癌的发病机制,制定有效的胃癌防治策略至关重要。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)被WHO列为I类致癌原,是胃癌的主要病因。Hp阳性患者的胃黏膜均存在慢性活动性胃炎,可进一步进展为萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生并最终导致胃癌的发生。Hp感染主要在这一胃黏膜病理演变阶段中扮演着“启动子”的角色,Hp感染诱导的胃内炎症在Hp致癌过程中起着重要作用。Hp的不同毒力因子可与宿主的受体或靶蛋白相互作用,导致炎症信号通路(例如NF-κB信号通路)的激活及促炎因子的释放,此过程是胃癌发生发展中的重要一步。我们通过基因集富集分析方法分析Hp阳性及阴性胃癌的差异基因富集的信号通路,发现NF-κB信号通路与Hp感染密切相关。活化的蛋白激酶C受体-1(receptor for activated C kinase1,RACK1)为胞浆的支架蛋白,已有研究报道其可通过负性调控WNT及NF-κB信号通路抑制胃癌的进展。此外,肿瘤基因图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据表明RACK1在胃癌中的表达低于癌旁。但何种机制调控RACK1的表达尚不清楚。众多基因参与调控NF-κB信号通路的活性。RACK1可作为NF-κB信号通路的负性调控者,抑制信号通路的激活及炎症因子的释放。此外,新近研究利用全基因组RNAi技术筛选特异调控Hp感染致NF-κB信号通路激活的基因,通过对646个激酶及激酶相关基因进行干扰并检测p65的入核率,发现RACK1可调控Hp感染诱导的NF-κB信号通路的激活,但相关机制未阐明。整合素(Intergrin,ITG)是由α和β两个亚基组成的异源二聚体跨膜蛋白,在生理及病理过程中发挥重要作用(例如免疫应答、细胞周期进展、细胞死亡、侵袭、转移及血管形成)。ITG可与Hp的毒力因子相互作用并激活下游的致癌信号通路,参与Hp致病过程。RACK1与ITG-β相结合并调控后者的功能,但是Hp感染、RACK1、ITG-β及NF-κB信号通路的相互关系如何未见报道。因此,本课题拟通过体内外实验系统探讨RACK1、ITG-β1及NF-κB信号通路在Hp致癌中的作用,为Hp的致癌机制提供新的理论依据及Hp相关胃癌的防治提供新的靶点。材料与方法:(一)RACK1在胃癌组织中的表达及与预后的关系:1.提取TCGA数据库胃癌信息并分析RACK1在胃癌及癌旁的表达;收集不同病理分期的胃癌及癌旁组织标本,Western blot方法检测RACK1在胃癌及癌旁的表达;2.免疫组化方法检测组织芯片(90对胃癌及癌旁)中的RACK1表达,并分析RACK1与胃癌临床病理参数及预后的关系。利用Kaplan-Meier plotter数据库分析RACK1与胃癌患者的预后关系;3.qRT-PCR方法检测不同分化阶段的胃黏膜上皮细胞中的RACK1 mRNA表达水平。(二)Hp感染对RACK1及NF-κB信号通路影响的体内外研究:1.生物信息学分析与Hp感染密切相关的信号通路及功能;2.建立Hp活菌体外与GES-1细胞共培养细胞模型,Western blot检测RACK1及NF-κB信号通路关键蛋白的表达,qRT-PCR方法检测NF-κB信号通路靶基因的表达;3.构建Hp感染蒙古沙鼠动物模型,Giemsa及PCR方法检测Hp在胃黏膜的定植,HE方法检测Hp感染介导的胃黏膜病变,免疫组化方法检测胃黏膜组织的RACK1及NF-κB信号通路关键蛋白的表达。(三)RACK1调控Hp感染介导NF-κB信号通路激活的机制:1.Hp活菌与RACK1过表达稳转GES-1细胞共培养,qRT-PCR方法检测NF-κB信号通路靶基因的表达及荧光素酶报告基因检测NF-κB信号通路的活性;2.生物信息学分析ITG-β1参与的生物学进程及ITG-β1在胃癌及癌旁的表达,通过GEPIA及Kaplan-Meier plotter数据库分析ITG-β1与胃癌患者的预后关系;3.通过体外Hp活菌与GES-1细胞共培养细胞模型,Western blot检测ITG-β1的表达;4.Hp活菌与RACK1低表达AGS细胞共培养,Western blot检测ITG-β1及NF-κB信号通路关键蛋白的表达;5.Hp活菌与ITG-β1低表达AGS细胞共培养,qRT-PCR方法检测NF-κB信号通路靶基因的表达及荧光素酶报告基因检测NF-κB信号通路的活性;6.同时干预RACK1及ITG-β1的表达水平,观察RACK1对调控Hp感染介导NF-κB信号通路激活是否通过ITG-β1。(四)胃黏膜不同病理阶段的RACK1、整合素β-1及NF-κB信号通路关键蛋白的表达及与Hp感染的关系:1.生物信息学分析RACK1、ITG-β1在Hp阳性及阴性胃癌中的表达;2.收集慢性胃炎、肠上皮化生及异型增生胃黏膜组织,通过免疫组化检测各病变阶段RACK1、ITG-β1及NF-κB信号通路关键蛋白的表达,并分析其与Hp感染的关系。结果:(一)RACK1在胃癌组织中的表达及与预后的关系:为了说明RACK1在胃癌中的作用,我们利用了TCGA数据库分析RACK1在胃癌及癌旁的表达,结果显示RACK1在胃癌中的表达显著低于癌旁。我们进一步利用Western blot及免疫组化方法分别检测23对胃癌及癌旁标本(南昌大学第一附属医院收集标本)及90对胃癌及癌旁标本(组织芯片)中RACK1的表达。Western blot数据显示RACK1在87%(20/23)的胃癌标本中的表达低于癌旁。与此结果相一致,免疫组化结果同样显示胃癌中RACK1的表达低于癌旁。我们利用Kaplan-Meier数据库分析876例胃癌患者中RACK1的表达与预后的关系,结果显示低表达RACK1的胃癌患者预后差。与分化程度差的胃黏膜上皮细胞(AGS及HGC-27细胞)相比,分化程度好的胃黏膜上皮细胞(GES-1及SGC-7901细胞)的RACK1 mRNA表达水平更高。(二)Hp感染对RACK1及NF-κB信号通路影响的体内外研究:胃癌患者中RACK1的表达下调,我们进一步阐明Hp感染对RACK1表达及经典NF-κB信号通路活性的影响。我们利用不同MOI的三种细菌(野生型的Hp ATCC43504、7.13菌株及cagA~-7.13菌株)作用于GES-1细胞并检测RACK1、P65及p-P65(Ser 536)的表达,结果显示Hp感染以MOI=100:1或200:1作用于GES-1细胞时可下调RACK1及上调p-P65(Ser 536)的表达,且此过程不依赖于Hp的毒力因子CagA。为了进一步验证此结果,我们利用野生型的Hp ATCC43504(MOI=100)及TNF-α(1ng/ml or 10 ng/ml)刺激GES-1细胞0、15、30、45、60及75分钟。虽然Hp感染及TNF-α处理组别均可上调p-P65(Ser 536)的表达及下调IκBα的表达,但只有Hp感染组的RACK1表达下调。此外,NF-κB信号通路靶基因(TNF-α,A20和IκBα)的表达上调,进一步提示NF-κB信号通路的激活。为了进一步验证我们的体外结果,我们构建了Hp感染蒙古沙鼠模型。Giemas染色及PCR方法均提示Hp成功定植于胃黏膜。HE染色结果提示在cagA~+及cagA~-7.13菌株组,部分老鼠的食管-胃结合部中可见炎症细胞浸润及上皮增生。通过免疫组化方法检测了RACK1、IκBα及核中的P65表达,结果提示Hp感染可下调RACK1及IκBα的表达、上调核内P65的表达。RACK1的表达水平与IκBα的表达水平呈正相关,而与核内P65的表达水平呈负相关。(三)RACK1调控Hp感染介导NF-κB信号通路激活的机制:为了进一步说明RACK1是否可调控NF-κB信号通路的活性,我们构建了RACK1过表达稳转GES-1细胞并感染Hp ATCC 43504菌株75分钟。与GES-1对照组相比,RACK1过表达组的NF-κB信号通路的活性降低及靶基因表达下降。我们的前期研究通过生物信息学分析TCGA数据中的胃癌数据发现ITG介导的信号通路与Hp感染呈正相关且ITG-β1参与众多生物过程。而ITG-β1在胃癌中的表达高于癌旁且高表达ITG-β1的胃癌患者预后差。此外,Hp感染可上调ITG-β1的表达。敲减内源性的RACK1可上调整合素β-1及p-P65(Ser 536)的表达。而敲减ITG-β1的表达可抑制NF-κB信号通路的活性及NF-κB信号通路的靶基因表达。为了进一步说明ITG-β1在RACK1抑制NF-κB信号通路中的作用,我们在过表达RACK1的AGS细胞中转入ITG-β1过表达质粒并感染Hp ATCC43504菌株75分钟,qRT-PCT及荧光素酶报告基因结果均提示过表达RACK1的同时补入ITG-β1可恢复NF-κB信号通路的活性。(四)胃黏膜不同病理阶段的RACK1、整合素β-1及NF-κB信号通路关键蛋白的表达及与Hp感染的关系:我们通过TCGA数据库分析了Hp阳性及阴性胃癌中RACK1、ITG-β1的表达,结果显示两组间的RACK1及ITG-β1的表达无差异。与此结果一致,RNA测序结果显示RACK1、ITG-β1在Hp阳性及阴性胃癌中表达无差异。为了揭示Hp感染在哪个病变阶段影响RACK1、ITG-β1及p-P65(Ser 536)的表达,我们收集了慢性胃炎、肠上皮化生及异型增生患者的胃黏膜并检测上述指标的表达。免疫组化结果显示Hp感染在癌前病变阶段(肠上皮化生、异型增生)可下调RACK1及上调ITG-β1的表达,而Hp感染可在慢性胃炎阶段上调p-P65(Ser536)的表达。以上结果提示Hp感染可在体内下调RACK1并上调ITG-β1及p-P65(Ser536)的表达。结论:1.Hp感染可下调RACK1的表达及促进经典NF-κB信号通路激活,此过程不依赖于毒力因子CagA。2.RACK1可通过调控ITG-β1的表达负性调节NF-κB信号通路的活性,在Hp感染致癌中发挥重要的作用。


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