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白藜芦醇通过DJ-1调控的SIRT1-p53途径抑制缺氧/复氧心肌细胞凋亡

徐兴旺  
【摘要】:目的:从DJ-1与SIRT1蛋白相互作用和SIRT1-p53途径的角度,在H9c2心肌细胞水平探讨白藜芦醇(RES)是否通过DJ-1调控的SIRT1-p53途径对抗缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡,产生心肌细胞保护作用。方法:1.在50μM RES预处理H9c2心肌细胞24 h之前,用Negtive control(NC)siRNA或DJ-1 siRNA瞬时转染H9c2心肌细胞24 h,随后进行H/R实验;采用Western Blot检查DJ-1蛋白的表达情况和免疫共沉淀(CO-IP)实验检测DJ-1和SIRT1蛋白相互作用情况,旨在观察RES预处理对缺氧/复氧的H9c2心肌细胞内DJ-1蛋白表达和DJ-1与SIRT1蛋白相互作用的影响,且探讨该效应是否可被DJ-1敲低所抑制。2.在50μM RES预处理H9c2心肌细胞24 h之前,用NC siRNA或DJ-1siRNA瞬时转染H9c2细胞24 h,或者在RES预处理后将H9c2心肌细胞与50μM SIRT1抑制剂Sirtinol或0.05%DMSO(作为阴性对照)孵育30 min,随后进行H/R处理;用SIRT1活性检测试剂盒检测SIRT1蛋白活性情况,旨在观察RES对H/R损伤的H9c2心肌细胞中SIRT1蛋白去乙酰化酶活性的影响,且探讨该效应是否可被Sirtinol和DJ-1敲低所抑制。3.在50μM RES预处理H9c2心肌细胞24 h之前,用NC siRNA或DJ-1siRNA瞬时转染H9c2心肌细胞24 h,或者在RES预处理后将H9c2心肌细胞与50μM Sirtinol或0.05%DMSO孵育30 min,随后进行H/R处理;采用Western Blot检查乙酰化p53(Ac-p53)和p53蛋白的表达情况,以观察RES预处理对H/R损伤的H9c2心肌细胞中p53表达和乙酰化的影响,同时观察该效应是否可被Sirtinol和DJ-1敲低所抑制。4.在50μM RES预处理H9c2心肌细胞24 h之前,用NC siRNA或DJ-1siRNA瞬时转染H9c2心肌细胞24 h,或者在RES预处理后将H9c2心肌细胞与50μM Sirtinol或0.05%DMSO孵育30 min,随后进行H/R处理;用流式细胞术检测细胞凋亡情况,旨在观察RES预处理对H/R损伤的H9c2心肌细胞凋亡的影响,以及探讨该效应是否会被Sirtinol和DJ-1敲低所抑制。5.在50μM RES预处理H9c2心肌细胞24 h之前,用NC siRNA或DJ-1siRNA瞬时转染H9c2细胞24 h,或者在RES预处理后将H9c2心肌细胞与50μM Sirtinol或0.05%DMSO孵育30 min,随后进行H/R处理;用CCK-8法测定细胞存活率和分光光度法测定LDH的释放,旨在观察RES预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤的影响,同时观察该效应是否会被Sirtinol和DJ-1敲低所抑制。结果:1.在NC siRNA转染H9c2心肌细胞中,与H/R组细胞相比,RES预处理可显著上调DJ-1蛋白的表达,同时增强DJ-1与SIRT1蛋白的相互作用,然而RES这些效应可被DJ-1敲低所逆转。2.H9c2心肌细胞经过H/R处理后,导致SIRT1的去乙酰化酶活性降低,但RES预处理可显著提高SIRT1活性。而该效应可分别被SIRT1特异性抑制剂Sirtinol和DJ-1敲低所抑制。上述结果表明在经H/R的H9c2细胞中,RES预处理可通过DJ-1依赖性的方式恢复缺氧/复氧的H9c2心肌细胞内SIRT1活性。3.H9c2心肌细胞经H/R处理后,p53蛋白表达及p53乙酰化水平均显著升高。重要的是,RES预处理可显著降低缺氧/复氧的H9c2心肌细胞内p53蛋白表达和p53乙酰化水平。然而该效应可分别被SIRT1特异性抑制剂Sirtinol和DJ-1敲低所抑制。上述结果表明在经H/R的H9c2心肌细胞中,RES预处理可通过DJ-1依赖性的方式增强SIRT1的活性进而降低H/R诱导的p53蛋白表达和乙酰化水平。4.H9c2心肌细胞经H/R处理后,细胞凋亡显著升高,而RES预处理可显著降低H/R诱导的细胞凋亡。有趣的是,RES的上述效应可被SIRT1特异性抑制剂Sirtinol和DJ-1敲低所抑制。上述结果表明在经H/R的H9c2心肌细胞中,RES预处理可通过DJ-1调控的SIRT1-p53途径减轻H/R损伤后的H9c2心肌细胞凋亡。5.H9c2心肌细胞经H/R处理后,LDH的释放增加和细胞存活率降低,而RES预处理可显著降低LDH的释放和提高细胞存活率。同样,RES上述效应也可分别被Sirtinol和DJ-1敲低所抑制。上述结果表明RES预处理可通过DJ-1调控的SIRT1-p53途径对抗H9c2心肌细胞H/R损伤,产生心肌细胞保护作用。结论:RES预处理可上调H/R心肌细胞内DJ-1蛋白表达,同时促DJ-1与SIRT1蛋白相互作用,进而增加SIRT1的去乙酰化酶活性,抑制p53蛋白表达和乙酰化,从而对抗H/R所诱发的细胞凋亡,产生心肌细胞保护作用。


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