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构建多发性骨髓瘤ceRNA网络图及lncRNA IRAIN的表达和预后分析

陈建  
【摘要】:背景:多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是好发于中老年人群,骨髓浆细胞和它分泌的免疫球蛋白及其多肽链异常增生的恶性疾病。伴随着我们国家人口的老龄化和诊断骨髓瘤手段的发展,该病在我们国家的发病率呈现为上升势头,并且发病有低龄化的倾向。尽管有一大批临床一线治疗新药的出现,使得患者的生存时间显著改善,但是由于耐药及复发问题,多发性骨髓瘤仍然属于无法根治状态。所以,从分子水平、基因水平来研究骨髓瘤的形成及演变,帮助该病在预防和治疗上提供关键的理论基础及实用价值。长链非编码RNA(long noncoding RNA,RNA)属于大分子的非编码RNA,指的是长度大于200个碱基,具有多种调控功能的一类RNA分子,它是由RNA聚合酶∥转录而来,经过剪切和加工处理后形成成熟lncRNA,但是不会被翻译成蛋白质,lncRNA在表观遗传调控、转录水平甚至转录后水平等方面对基因进行调控。微小RNA(microRNA,miRNA)是普遍在原核及真核生物体内表达的一种RNA,并且它的长度大约是20个碱基的非编码单链小RNA。近几年有研究提示,竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)能够在分析恶性肿瘤的发病机制时当做潜在的治疗靶点和生物标志物,这展现出了极其重要的临床应用价值和研究意义。同时也有大量的数据表明,外周血中的lncRNA能够当做恶性肿瘤潜在的治疗靶点,帮助恶性肿瘤的诊断、提示预后等状况并且能够提前判断具体对药物的治疗效果和耐药问题甚至为恶性肿瘤的形成机制探究指出了方向。目的:鉴别多发性骨髓瘤中特征性长链非编码核糖核酸(long noncoding RNA,RNA),并检测相关lncRNA在骨髓瘤中的表达水平,研究其与骨髓瘤临床病理特征的相关性,最终得出对骨髓瘤基因诊断和靶向治疗相关的思路和理论依据。方法:在相关数据库(TargetScan数据库和mirDB数据库)下载初治和复发的骨髓瘤样本数据,检测出相应差异表达的miRNA(differentially expressed microRNA,DE-miR),再在相关数据库提取出感兴趣的lncRNA(differentiallyexpressed long noncoding RNA,DE-lncRNA)及mRNA(differentially expressed messenger RNA,DEG),提取感兴趣lncRNA和mRNA及相应的FPKM值,0值替换为最小值的1/2,并用log10(FPKM)值绘制热图,参数scale=row。然后利用TargetScan和mirDB预测热图中提供的miRNA的靶基因,mirDB过滤参数(TargetScore80),然后和本次测序结果里面有统计学意义的差异mRNA取交集后,做venn图。以venn图交集中的基因为目的基因,提取其对应的miRNA(选取TargetScan和mirDB都预测到的miRNA-mRNA互作对作为ceRNA分析的结果),并且结合选取的lncRNA及其对应miRNA,选取既调控mRNA又调控lncRNA的miRNA作为最终ceRNA分析的miRNA,将这些共对应表达RNA放在多个数据库中研究,探究它们之间的关联,接着构建mRNA-miRNA网络及lncRNA-miRNA网络,最后把它们两者整合成lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络调控图。接着我们利用Cytoscape软件对的出来的ceRNA网络调控图进行可视化操作,运用描述网络拓扑性质的一些重要特征(边聚集系数、皮尔逊相关系数)来筛选出ceRNA网络图中的关系对。收集2012年1月—2018年10月在南昌大学第一附属医院诊断的多发性骨髓瘤患者骨髓20例及对照组骨髓20例,分别抽取骨髓5ml,用EDTA抗凝试采血管采集,提取总RNA,后逆转录成cDNA,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测IRAIN在骨髓及外周血中的表达量,同时分析IRAIN表达水平与相应临床病理特征的相关性,得出的结果使用统计学软件SPSS 19.0分析。结果:1.我们最终从venn图中得出了279个相互交集的基因,选取到了既调控mRNA又调控lncRNA的12条miRNA作为最终ceRNA分析的miRNA,他们共对应18个lncRNA和118个mRNA2.在骨髓瘤患者血浆中检测出来的LncRNA IRAIN与正常对照组相比表达下调(P0.05),骨髓瘤患者血浆中的IRAIN表达水平和其对应的患者的年龄、性别、国际分期及分型无显著相关性(P0.05),骨髓瘤患者血浆中的IRAIN表达水平和其对应的患者的细胞遗传学异常有密切相关(P0.05),有细胞遗传学异常的患者相对于没有的患者LncRNA IRAIN的表达水平明显降低结论:1.LINC01800和LINC02357在患者骨髓组织中显著高表达,然而LIN104472848(IRAIN)在正常样本中高表达,在患者骨髓组织中显著低表达,由于LNCRNA IRAIN的异常表达情况,有可能该指标与骨髓瘤的发病机制和形成发展有密切关系,在调控骨髓瘤复发中的分子机制中有着非常显著的作用。2.LNCRNA IRAIN在骨髓瘤血浆中的的表达水平与正常对照组相比显著降低,说明IRAIN有可能是当做抑癌基因的角色,在调控着骨髓瘤的的发生发展,IRAIN在体内的表达水平与骨髓瘤患者是否存在细胞遗传学异常有着密切的联系,有细胞遗传学异常的的骨髓瘤患者IRAIN的表达水平相对于没有异常的表达水平要显著减低,表明IRAIN有可能作为抑制成分介入到肿瘤的形成过程,并且IRAIN有可能成为多发性骨髓瘤的一个有预测意义的生物标志物和为个体化治疗提供了治疗靶点。


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