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MicroRNA-140-5p通过THY1介导的Notch信号通路抑制胃癌进展

吴昆  
【摘要】:一、研究背景胃癌最目前世界上常见的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的生命健康。在大约90%的癌症病例中,侵袭和转移是患者死亡的主要原因。胃癌的转移及复发严重危及患者的生命,与患者不良预后相关,这突显出迫切需要有效的新治疗方案。虽然最近的研究已经探索了多种新的分子靶点来诊断和治疗胃癌,但批准用于临床的针对特定靶点的抗胃癌药物依然缺乏。因此,开发针对胃癌新靶点的药物对改善患者预后有重要的临床意义。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一种内源性的小分子非编码RNA,通过转录调控机制来阻碍蛋白编码基因表达;然后通过与蛋白编码基因的信使RNA(mRNA)的3’非翻译区的序列(3’UTR)相结合,从而达到阻滞mRNA的翻译或者诱导其降解的作用。据统计,人类的蛋白编码基因中的受到miRNA调控后转录的占60%左右;而在诸多不同性质的肿瘤中,也存在特异性的miRNA或者miRNA家族表达和功能的异常。最近,研究者对miR-140-5p在肿瘤中的作用机制的研究越来越多。在结直肠癌、胆管癌和下咽癌等研究中发现miR-140-5p均起到肿瘤抑制因子的作用。在胃癌相关研究报道中,miR-140-5p在患者血浆中的表达水平明显升高,但另一些研究者却发现在组织标本和胃癌细胞系HGC-27中,miR-140-5p的表达水平却是下调的。更重要的是,miR-140-5p是否与胃癌患者预后相关以及在胃癌发生发展中的作用机制尚不清楚。因为单个miRNA分子可能靶向调控多种蛋白编码基因,所以miR-140-5p在胃癌的发生发展中起何作用需要进一步的深入研究及探讨。THY1是参与细胞与细胞基质之间细胞相互作用的关键调节因子。之前的一项研究表明,THY1也称为CD90基因,在胃癌中表现出高表达水平,并通过调节SPARC蛋白的表达来抑制胃癌细胞的凋亡。生物信息学在线预测软件以及双荧光素酶报告基因测定在该研究中的应用提供了证实THY1作为miR-140-5p的直接靶基因的证据。研究表明,miR-140-5p可作为结直肠癌,胆管癌和下咽癌的肿瘤抑制因子。此外,已经在胃癌中观察到miR-140-5p的下调表达,有报道表明它可以起到抑制胃细胞增殖的作用。Notch通路是参与肿瘤干细胞调控的重要通路之一。靶向Notch通路可以抑制肿瘤生长并促进肿瘤干细胞的凋亡。以前的研究已经揭示了胃癌细胞中Notch信号通路的激活,同时将其与肿瘤形成和发展过程联系起来。越来越多的研究强调了THY1参与调节Notch信号通路的能力。因此,本研究旨在研究miR-140影响胃癌细胞增殖的机制。二、材料和方法1.选取105对新鲜配对的胃癌组织及癌旁正常组织,采用实时定量PCR检测,Western blot检测分析miR-140-5p及THY1的差异表达情况。2.检索MirDIP等数据库并使用在线生物信息学预测软件预测miR-140-5p可以与THY1 mRNA 3’UTR结合。3.通过MTT、克隆形成、划痕和Transwell等实验证明miR-140-5p及THY1的表达与胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞凋亡的关系。4.验证MicroRNA-140-5p通过THY1介导的Notch信号通路的负调控抑制胃癌细胞增殖,迁移和促进细胞凋亡。三、结果1.GC组织中miR-140-5p的低表达和THY1的高表达根据我们关于miR-140-5p能否通过调节THY1影响GC的可能性的推测,检测miR-140-5p和THY1在GC组织和癌旁组织中的表达。基于RT-qPCR和Western印迹分析的结果,在GC组织和癌旁组织之间观察到miR-140-5p和THY1表达存在差异。进而对miR-140-5p与GC组织样本中THY1表达进行相关性研究,结果显示miR-140-5p与THT1呈负相关。这些结果提供了确凿的证据表明,与癌旁组织相比,GC组织中miR-140-5p的表达较低,与THY1的高表达相反。2.miR-140-5p和THY1的表达与GC的进展相关基于分析miR-140-5p和THY1表达之间的关系以及GC中的临床病理学特征,对所有GC患者的临床病理特征进行相关性分析。根据miR-140-5p和THY1的中位数水平,GC患者被分为低表达组和高表达组。结果显示,miR-140-5p表达与性别和年龄之间不存在相关性,而与分化程度(p=0.026),淋巴结转移(p=0.002),临床分期(p=0.033)、侵润深度(p=0.018)有显着相关性。和渗GC患者。同样,GC患者THY1的表达与性别和年龄之间没有相关性,而与分化程度(p0.001),淋巴结转移(p0.001),临床分期(p=0.003)和浸润程度存在显着相关性(p=0.001)。3.miR-140-5p可调控THY1的表达microrna.org的在线生物信息学软件预测THY1为miR-140-5p的靶基因。随后,双荧光素酶报告实验结果显示,miR-140-5p可以通过与THY1 mRNA3’UTR结合而下调THY1的表达。4.miR-140-5p过表达抑制THY1表达和Notch信号通路实验部分确定miR-140-5p通过THY1影响Notch信号传导途径的机制。在胃癌SGC-7901细胞系中通过miR-140-5p过表达及敲降,THY1和Notch信号传导途径相关的NICD,HES1和HES5在mRNA水平及蛋白水平被抑制或过表达。该结果证实miR-140-5p对胃癌SGC-7901细胞系中THY1表达和Notch信号通路起负调控作用。5.miR-140-5p抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭MTT实验证实,胃癌SGC-7901细胞系中加入miR-140-5p mimic可显著抑制细胞的增殖,而加入miR-140-5p inhibitor可促进细胞的增殖。细胞划痕实验证实,胃癌SGC-7901细胞系中加入miR-140-5p mimic可显著抑制细胞的迁移,而加入miR-140-5p inhibitor可促进细胞的迁移。Transwell实验证实,胃癌SGC-7901细胞系中加入miR-140-5p mimic可显著抑制胃癌细胞的侵袭能力,而加入miR-140-5p inhibitor可促进胃癌细胞的侵袭。上述实验证实,miR-140-5p可以抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭。6.miR-140-5p促进胃癌细胞的凋亡细胞流式术实验显示miR-140-5p mimic可促进胃癌细胞的凋亡,而加入miR-140-5p inhibitor可抑制胃癌细胞的凋亡。Western Blotting显示miR-140-5p通过上调Bax及Caspase-3、PARP1的表达,下调Bcl-2、Notch1而产生促进细胞凋亡的作用四、结论1、通过胃癌患者组织标本检测联合生物信息学miR-140-5p在胃癌组织中较癌旁正常组织下调。2、miR-140-5p对人胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭存在负调控作用,并且促进胃癌细胞的凋亡。3、miR-140-5p主要通过负调控THY1及Notch信号通路起到抑制胃癌发生发展的生物学作用。


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