亚麻醉剂量艾司氯胺酮调控小胶质细胞TLR4/NF-κB通路对术后认知影响及机制研究

【摘要】：围术期神经认知紊乱(Perioperative neurocognitive disorders,PND)是手术或麻醉引起的中枢神经系统的并发症,其临床表现为智力降低,记忆力下降,注意力不集中,决策力、理解力、语言、警觉和心理障碍,大多患者持续数周至数月,少数导致永久损害。其病因主要有年龄、基础疾病、手术、炎症应激反应等,高龄和手术是目前认为导致PND的主要风险因素。迄今为止,虽然投入大量人力物力进行认知研究,但目前尚无有效的循证治疗手段。小胶质细胞是神经胶质细胞的一种,是中枢神经系统中最重要的免疫效应细胞。大多神经退行性疾病都与慢性炎症相关,这种慢性炎症的中心环节即是小胶质细胞。在一些病理情况下,小胶质细胞可长时间保持在活化状态,并分泌多种炎症因子。Toll样受体家族(Toll-like receptors,TLR)是模式识别受体,在脑内主要表达于小胶质细胞,在脑损伤和神经变性中起关键作用。TLR通路的激活增加了各种促炎细胞因子的表达,例如IL-6,IL-1和TNF-α。艾司氯胺酮是氯胺酮的旋光异构体,与多种受体相互作用。研究表明氯胺酮具有抗抑郁及抗炎作用。目前艾司氯胺酮的研究主要集中在抗抑郁方面,其不同剂量及用药时间对术后神经认知的影响仍未见报道。本研究发现,亚麻醉剂量艾司氯胺酮可通过抑制小胶质细胞增生,并抑制TLR4/NF-κB信号通路,减少炎症因子产生,从而改善神经认知功能,为寻找并确定PND治疗靶点提供实验依据及新思路。第一部分艾司氯胺酮剂量对术后认知功能的影响目的:探索艾司氯胺酮改善老龄小鼠术后认知功能障碍的最佳亚麻醉剂量。方法:18月龄C57BL/6小鼠,随机分为两组,即对照组(C组)和手术组(S组),手术组建立剖腹探查手术模型,造模后3天行旷场实验及水迷宫行为学检测。随后C组分为4个亚组(CK0,CK1,CK2,CK3),S组分为4个亚组(SK0,SK1,SK2,SK3),分别腹腔注射不同剂量艾司氯胺酮(0mg/kg,5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg)1周,再次行旷场实验及水迷宫行为学测试。结果:1.旷场实验中手术组小鼠较对照组小鼠运动距离、运动速度下降(P0.01),跨格次数减少(P0.01),直立次数减少(P0.05)。水迷宫实验中手术组小鼠定位航行阶段潜伏期较对照组延长(P0.01);空间探索阶段,手术组小鼠目标象限停留时间及穿越平台次数较对照组减少(P0.001)。2.给予不同剂量艾司氯胺酮处理后,旷场实验显示,对照组各组间运动距离、运动速度、跨格次数、中央格停留时间以及直立次数无统计学差异;手术组中,SK0组较对照组各组(P0.01)及SK2组(P0.05)运动距离、运动速度下降;SK0组和SK3组较对照组各组跨格次数明显减少;SK0组较对照组各组直立次数明显减少(P0.05);与CK2、CK3组相比,SK3组直立次数明显减少(P0.05),差异具有统计学意义。水迷宫实验显示给予不同剂量艾司氯胺酮后,定位航行阶段对照组各组及SK1组、SK2组逃避潜伏期均随训练天数增加而缩短;手术组中SK0组和SK3组随训练天数增加逃避潜伏期无明显缩短。空间探索阶段SK0组和SK3组目标象限停留时间较对照组各组缩短,SK0组较SK2组目标象限停留时间也缩短(P0.05);穿越平台次数SK0组较对照组各组(其中与CK0,CK1组相比P0.01;与CK2,CK3组相比P0.05)及SK2组(P0.05)明显减少。结论:剖腹探查手术可引起老龄小鼠术后认知功能障碍;一定亚麻醉剂量艾司氯胺酮具有神经认知保护作用,选取艾司氯胺酮10mg/kg作为药物处理剂量。第二部分艾司氯胺酮通过抑制小胶质细胞TLR4/NF-κB通路对术后认知功能障碍的影响目的:通过手术及脂多糖刺激,研究艾司氯胺酮是否通过抑制小胶质细胞TLR4/NF-κB信号通路产生神经认知保护作用。方法:18月龄C57BL/6小鼠,分为对照组(Control),模型组(Model),模型+艾司氯胺酮组(Model+K2),模型+艾司氯胺酮+LPS组(Model+K2+LPS),模型+LPS组(Model+LPS)。建立剖腹探查手术模型,Model+K2组造模后给予10mg/kg艾司氯胺酮处理;Model+K2+LPS组造模后分别给予艾司氯胺酮及脂多糖处理;Model+LPS组造模后给予脂多糖处理。通过行为学测试观察老年小鼠自主活动能力及学习记忆能力;qPCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6m RNA水平;Western Blot检测Iba-1、TLR4蛋白表达和p65蛋白磷酸化水平;免疫荧光检测Iba-1和p-NF-κBp65荧光强度。结果:1.旷场实验结果显示,与Control组比较,Model组及Model+LPS组小鼠运动距离、运动速度明显减少(P0.01);Model+K2组较Model+LPS组运动距离、运动速度明显增加(P0.01)。Model+LPS组小鼠跨格次数较Control组(P0.01)及Model+K2组(P0.05)和Model+K2+LPS(P0.05)组明显下降。Model+LPS组小鼠较Control组中央格停留时间缩短(P0.05)。直立次数比较,Model组(P0.05)及Model+LPS组(P0.01)小鼠较Control组明显减少;Model+LPS组较Model+K2组明显减少(P0.05),差异有统计学意义。2.水迷宫实验结果显示,定位航行阶段,除Model组及Model+LPS组外,其余各组小鼠随着训练天数增加,逃避潜伏期均逐渐缩短(P0.01)。Model组及Model+LPS组小鼠较Control组及Model+K2组逃避潜伏期增加;与Model+LPS组比较,Model+K2+LPS组逃避潜伏期缩短(P0.05)。空间探索阶段,与Control组比较,Model组及Model+LPS组小鼠目标象限停留时间及穿越平台次数明显减少(P0.01);与Model组及Model+LPS组比较,Model+K2组小鼠目标象限停留时间明显增加(P0.05);与Model组(P0.05)及Model+LPS组(P0.01)比较,Model+K2组小鼠穿越平台次数明显增加,差异有统计学意义。3.采用qPCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA的水平,结果显示,与Control组相比,Model组及Model+LPS组TNF-α、IL-1βm RNA水平明显升高(P0.05);与Control组相比,Model+LPS组IL-6 m RNA水平亦明显升高(P0.05);Model+K2组较Model+LPS组IL-6 m RNA水平下降(P0.05)。4.Western Blot结果显示,Model+LPS组Iba-1、TLR4蛋白水平和p65蛋白磷酸化水平较Control组明显升高(P0.01);与Model+LPS组比较,Model+K2组Iba-1(P0.05)、TLR4(P0.01)蛋白表达和p65蛋白磷酸化水平(P0.05)下降;与Model+LPS组比较,Model+K2+LPS组Iba-1、TLR4蛋白表达水平下降(P0.05),差异具有统计学意义。5.免疫荧光结果显示,与Control组相比,Model组及Model+LPS组Iba-1和p-NF-κBp65标记阳性区域增加(P0.01);与Model+LPS组相比,Model+K2组Iba-1及p-NF-κBp65标记阳性区域减少(P0.05),差异具有统计学意义。结论:1.手术及LPS刺激促进老龄小鼠中枢神经系统小胶质细胞激活,上调TLR4/NF-κB信号通路,促进神经炎症反应,导致神经认知功能障碍。2.艾司氯胺酮抑制老龄小鼠中枢神经系统小胶质细胞TLR4/NF-κB信号通路,减少炎症因子水平,改善神经炎症反应,缓解术后神经认知功能障碍。第三部分细胞实验验证艾司氯胺酮调控小胶质细胞炎症水平的机制目的:体外细胞实验确证艾司氯胺酮通过抑制BV2细胞TLR4/NF-κB信号通路减少炎症反应。方法:采取BV2小胶质细胞系,培养的细胞分为:Control组,LPS组,LPS+K组,LPS+TAK-242组,LPS+TAK-242+K组。Control组用PBS预处理BV2细胞;LPS组用1μg/m L LPS损伤处理;LPS+K组给予1μg/m L LPS及5μg/m L艾司氯胺酮处理;LPS+TAK-242组给予1μg/m L LPS及100nmol/L TAK-242溶液处理;LPS+TAK-242+K组给予1μg/m L LPS,100nmol/L TAK-242溶液及5μg/m L艾司氯胺酮溶液处理,24h后MTT检测细胞活力;qPCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA水平;免疫荧光Iba-1观察不同组间BV2细胞形态,检测TLR4和p-NF-κBp65荧光强度。结果:1.MTT结果显示,与其余各组比较,LPS组小胶质细胞存活率下降,差异具有统计学意义(P0.01)。2.qPCR结果显示,与对照组比较,LPS组炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6m RNA水平明显升高(P0.01),艾司氯胺酮或TAK-242干预后,炎症因TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA水平均降低(P0.01)。用艾司氯胺酮联合TAK-242干预后炎症因子IL-1β和IL-6 m RNA进一步降低(P0.05),差异具有统计学意义。3.免疫荧光结果显示,LPS处理后BV2小胶质细胞被激活,胞体变大、变圆,突起减少,呈现为类阿米巴样。LPS处理后TLR4及p-NF-κBp65荧光增强,艾司氯胺酮及TAK-242处理后TLR4及p-NF-κBp65荧光减弱。结论:LPS通过激活BV2细胞TLR4/NF-κB信号通路引起促炎因子表达增加;艾司氯胺酮对BV2细胞中LPS诱导的炎症反应起保护作用,其机制可能为抑制TLR4/NF-κB信号通路。