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禾谷镰刀菌的分离鉴定、毒素检测及降毒素基因Tri101的表达

董飞  
【摘要】:小麦赤霉病又称红麦头,由禾谷镰刀孢属真菌引起,是小麦生产上的一种重要病害,对小麦产量影响很大,重病田产量损失可达50%以上。小麦赤霉病主要分布在潮湿和半潮湿区域,尤其是在气候湿润的温带地区发生严重。在国内,小麦赤霉病主要分布在长江流域和沿海麦区,尤其是江苏省发病严重。镰刀菌感染小麦后产生真菌毒素多达数十种,其中主要有单端孢霉烯毒素,包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),玉米赤霉烯酮(ZEN)以及伏马毒素(Fumonisin, FB1)。小麦赤霉病毒素对人畜具有较大的危害性,如何使用生物学方法来降解这些毒素具有重要意义。 本文通过HPLC检测技术对江苏省内100个品种的小麦进行产毒力分析,结果表明:所有品种都受到了DON毒素的污染,绝大多数品种受到了ZEN毒素的污染,其中品种3210污染情况最为严重,DON检出量为2060μg/L, ZEN的检出量为3048.88gg/L。从样品3210中成功分离到一株产毒能力强的菌株F3210,经过分子鉴定此菌株与已报道菌株F15具有高度同源性。从所分离的菌株F3210中成功克隆到目的基因Tri101,据报道该基因是一种编码单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶(trichothecene 3-O-acetyltransferase)的结构基因,与镰刀菌抵抗自身毒素有关。通过原核和真核表达体系的构建都均能成功表达出目的蛋白。结果表明,经IPTG诱导3小时后的重组表达菌株BL21-pET29a-Tri101表达量最高,表达产物以包涵体形式存在,镍柱纯化时以200mM咪唑浓度最佳。而重组菌株X33-pPICZa-A-Tri101在经过0.5%甲醇诱导后在菌液上清中同样获得表达产物。接下来将进一步改造表达载体以获得有活性的目的蛋白,为深入研究Tri101基因在降毒素过程中的作用以及为抗赤霉病小麦的研究打下基础。


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