鸦胆子化学成分及药理活性研究

【摘要】：鸦胆子(Brucea javanica(L.)Merr.)是苦木科(Simaroubaceae)鸦胆子属(Brucea)植物鸦胆子的干燥成熟种子。目前,已经充分开发应用鸦胆子油乳,鸦胆子油乳或软胶囊已经作为临床一线抗癌药在中国上市销售,临床用于多种癌症的辅助性治疗。虽然鸦胆子已有明确的药理作用,但是其药效物质基础模糊;生产鸦胆子油乳剩下了许多的药渣,不能充分发挥鸦胆子的药用价值,故本课题基于鸦胆子的研究现状,用鸦胆子种子除去鸦胆子油,研究剩余部分水提物和醇提物的化学成分和生物活性。本实验将传统的提取分离手段与制备液相色谱等现代分离技术相结合,对醇提物过HP20大孔树脂的20%乙醇洗脱部分进行化学成分分离。利用大孔树脂HP20、MCI柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备HPLC等方法分离到了11个化合物,采用HR-ESI-MS,~1H-NMR,~(13)C-NMR等鉴定技术确定了9个化合物的结构:yadanzigan(1)、bruceine E(2)、20-hydroxy-yadanzigan(3)、bruceine F(4)、bruceine H(5)、bruceine D(6)、异香草酸(isovanillic acid 7)、对羟基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid 8)、邻苯二酚(pyrocatechol 9)。其中20-hydroxy-yadanzigan是一种新化合物,并且首次从鸦胆子中分离出异香草酸。本课题运用现代分离纯化手段处理鸦胆子水提物,鸦胆子粗多糖先进行透析(MW:3000)出去小分子杂质,并且根据多糖表面电荷的不同和分子大小差异,依此用DEAE-52和Sephadex G-200对粗多糖进行分离提纯,得到2个均一多糖BPS1和BPS2。HPGPC显示BPS1和BPS2均为平滑的单峰,说明2种多糖都是均一多糖。采用单糖组成分析、甲基化分析等化学方法,结合气质联用、原子力显微镜以及核磁等仪器分析技术,对2个鸦胆子均一多糖进行了结构表征,得到了它们的单糖组成、糖残基连接类型等结构信息。BPS1单糖组成:木糖、葡萄糖。摩尔比为5:7,平均分子量(MV)为13.4 kDa,BPS2单糖组成:木糖、葡萄糖。摩尔比为3:4,平均分子量(MV)为18.6 kDa;在BPS1中检测到三种残基,即1,4-Xylp→,→1,3-Glup→和→1,4,6-Glup→,BPS2中检测到三种残基,即T-Xylp→,→1,4-Glup→和→1,4,6-Glup→。在化学研究工作的基础上,本课题结合文献资料和现有实验条件,研究了分离得到的部分化合物的体外抗补体和抗炎活性。为了评价鸦胆子各化合物(均一多糖以及单体化合物)的抗补体活性,在本实验中,测定了部分化合物补体经典途径的溶血活性,结果表明,苦木素类化合物具有较强抗补体活性(CH_(50)为0.027~0.058 mg/mL),且抗补体活性稍强于阳性对照肝素钠(CH_(50)=0.066±0.003 mg/mL)。本实验对鸦胆子的抗补体活性成分进行了初步筛选,为苦木素类成分在体内发挥清热解毒活性的作用机制研究奠定了基础。测定了分离的苦木素类化合物的抗炎活性,抗炎结果显示:对LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型,6种苦木素类化合物均有不同程度的抑制活性,其中化合物1(yadanzigan)具有很强的抑制活性(IC_(50)=29.69μM)且对RAW264.7细胞几乎无毒性。因此,我们选择化合物1来做进一步实验研究釆用ELISA试剂盒检测相关细胞因子的释放以及Western印迹检测相关炎症通路各种蛋白的表达情况。结果显示,yadanzigan可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子iNOS,COX-2,TNF-α和IL-6的表达;yadanzigan通过抑制NF-κB通路的激活来抑制炎症的产生。本课题对鸦胆子的抗炎活性成分进行了初步筛选,为苦木素类成分在体内发挥抗炎活性的作用机制研究奠定了基础。