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基于血小板对肿瘤细胞的作用探讨丹酚酸B抗肿瘤作用及其机制

喻娟娟  
【摘要】:目的:血瘀证是恶性肿瘤患者的临床症状之一,血瘀贯穿肿瘤的发生、发展的全过程。恶性肿瘤患者体内血液处于浓、粘、聚、凝等高凝状态,而血小板异常是血液高凝状态的病理生理基础。丹参是常用的活血化瘀中药,研究表明具有抗肿瘤增殖活性,但其机制研究主要围绕细胞毒作用展开,这并不能完全体现其活血化瘀特点。鉴于血小板异常在肿瘤血瘀证中的作用,本论文从血小板对肿瘤细胞的作用这一角度,探究丹参的主要活性成分之一丹酚酸B对卵巢癌ID8细胞增殖的抑制作用及其作用机制,并与血小板P2Y_(12)受体抑制剂Ticagrelor的作用进行了对比研究,为探索丹参活血化瘀功效及其抗癌作用间的内在联系、阐明其作用特点提供证据。方法:(1)取Km小鼠下腔静脉血,离心分离制备血小板。采用血小板聚集实验方法,筛选出诱导剂ADP诱导血小板最适的浓度;(2)制备不同血小板数量的悬液,选取实验研究得出的ADP诱导血小板聚集的最适浓度激活含有不同数量的血小板的悬液,待血小板完全活化之后,离心取上清液,得到富含血小板释放颗粒的血小板上清液,分别将未活化的血小板上清液、ADP诱导活化的血小板上清液与ID8细胞共孵育24h,MTT实验方法检测ID8细胞增殖,筛选最适血小板数量的血小板上清液与ID8细胞共孵育;(3)采用MTT实验方法,筛选丹酚酸B和Ticagrelor对ID8细胞的毒性作用浓度;根据前期实验研究结果,以血小板对肿瘤细胞的作用为切入点,探讨丹酚酸B和Ticagrelor对ID8细胞增殖的影响。采用MTT实验方法测定血小板上清液与ID8细胞共同孵育时,ID8细胞活力;SRB实验方法测定血小板上清液与ID8细胞共同孵育时,ID8细胞生长曲线规律;平板集落克隆形成实验测定血小板上清液与ID8细胞共同孵育时,各组浓度药物对ID8细胞克隆形成能力的影响。探讨丹酚酸B和Ticagrelor对ID8细胞增殖影响的作用机制,采用Western blot实验方法检测PI3K/Akt信号通路中的PI3K110β、PDPK1、p-PDPK1(Ser241)、pan-Akt、p-Akt1(Ser473)、p-GSK3β(Y216)6个蛋白的表达情况。结果:1.血小板聚集实验显示:当血小板聚集率为70%左右时,ADP浓度为20u M。因此选择ADP浓度为20u M诱导血小板聚集。2.不同数量的血小板上清液与ID8细胞共孵育,MTT检测ID8细胞活力实验结果显示:无论有无ADP激活的情况下,血小板上清液均能促进卵巢癌ID8细胞增殖。当血小板数量为2×10~7个/m L时,活化后的血小板上清液孵育卵巢癌ID8细胞存活率为173.88%±0.113(P0.01),相比其他组卵巢癌ID8细胞存活率最高,与空白对照组比较细胞存活率显著增高(P0.01)。3.丹酚酸B和Ticagrelor对细胞增殖的影响MTT实验结果显示:各组不同浓度的丹酚酸B和Ticagrelor对ID8细胞增殖具有显著的抑制作用(P0.05)。4.MTT实验结果显示:无论是未活化的血小板上清液还是ADP诱导活化的血小板上清液与ID8细胞共孵育,各组不同浓度的Sal-B和Ticagrelor能够显著抑制ID8细胞的增殖(P0.01),抑制作用呈浓度依赖性。5.SRB实验结果显示与MTT实验结果相似。6.生长曲线实验结果显示:无论是未活化的血小板上清液还是ADP诱导活化的血小板上清液与ID8细胞共孵育,ID8细胞生长相似。对照组细胞呈现先指数增长,然后进入平台期,各给药组细胞数目缓慢增长,然后开始减少,细胞凋亡死亡。7.平板集落实验结果显示:无论是未活化的血小板上清液还是ADP诱导活化的血小板上清液与ID8细胞共孵育,各组不同浓度的丹酚酸B和Ticagrelor均能显著降低ID8细胞的克隆形成能力。8.Western blot实验结果表明,无论是未活化的血小板上清液还是ADP诱导活化的血小板上清液与ID8细胞共孵育,丹酚酸B和Ticagrelor可下调PI3K/AKT信号通路中的PI3K110β、PDPK1、p-PDPK1(Ser241)、pan-Akt、p-Akt1(Ser473)、p-GSK3β(Y216)6个蛋白的表达。结论:1.无论是未活化的血小板上清液还是ADP诱导活化的血小板上清液均能够促进卵巢癌ID8细胞增殖。2.无论是未活化的血小板上清液还是ADP诱导活化的血小板上清液与ID8细胞共孵育,丹酚酸B和Ticagrelor均可显著抑制ID8细胞的增殖。3.无论是未活化的血小板上清液还是ADP诱导活化的血小板上清液与ID8细胞共孵育,丹酚酸B和Ticagrelor对ID8细胞的抑制作用可能是通过下调PI3K/Akt信号通路中的PI3K110β、PDPK1、p-PDPK1(Ser241)、pan-Akt、p-Akt1(Ser473)、p-GSK3β(Y216)6个蛋白的表达。


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