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激活素A/卵泡抑素在胶质母细胞瘤中的表达及其对U87MG作用的研究

张道福  
【摘要】:背景 神经胶质瘤是成人脑肿瘤中最为常见也是最为致命的肿瘤之一,大约占所有确诊的脑肿瘤病例的70%,是青壮年与癌症相关的第二位的致死原因并且其发病率相当高,病人初次确诊后生存时间大约为9-12个月。 文献已经证明大量的细胞因子参与了胶质瘤的发生发展过程,比如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases)、转化生长因子-β(transforming growth factory-beta,TGF-Bs)超家族等等。TGF-Bs超家族包括TGF-β、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)和激活素(activin, ACT)。有研究表明通过小干扰RNA沉默TGF-β1和TGF-β2的基因的人类Ⅳ级胶质瘤细胞株LNT-229失去了其在裸鼠中的致肿瘤作用。与此相反的是有研究表明BMP-2在Ⅳ级胶质瘤中是高表达的并且与病人的生存期呈正相关。 ACT A最初是在垂体前叶中被发现的,是由两个B亚单位βA或者βB组成的糖蛋白,根据组成激活素的亚单位的不同被分成ACT A (BABA)、ACTB (βBβB)和ACTAB (BABB)三种二聚体,目前研究最多的是ACTA。ACT A与其他的TGF-β超家族成员的作用机制相似,也是主要通过Smad信号通路介导。目前的研究发现,ACT A在其他肿瘤中的生物学作用根据肿瘤组织类型的不同而有差异,或者起促进肿瘤增值的作用,或者促进肿瘤细胞的凋亡。卵泡抑素(follistatin, FS)是ACT的天然拮抗剂,通过与ACT亚单位的紧密结合使其失去生物学效应;ACT与FS共同调节组织器官以及肿瘤的的发生发展系统。目前关于ACT A在胶质瘤中的表达以及其生物学效应的研究甚少,ACT A/FS在胶质瘤的发生发展过程中的作用有待于进一步研究。 目的 本文通过研究ACT A/FS在胶质母细胞瘤中的表达及其在体外对胶质瘤细胞株增殖的影响,探讨ACT A/FS在胶质瘤的发生发展中的作用。 材料与方法 1.病理标本的检测 2006年7月至2008年7月在齐鲁医院收集31例胶质母细胞瘤标本和8例正常脑组织标本。所有与病人有关的实验研究都是经过山东大学齐鲁医院医学伦理委员会根据1964年赫尔辛基宣言的医学伦理原则的授权许可,所有病人都同意参与该实验研究。免疫组化法检测胶质母细胞瘤ACT A、FS、p-Smad2/3的表达,RT-PCR检测ACT A、FSmRNA的表达,western blot检测p-Smad2/3。 2.细胞培养 U87人类恶性胶质瘤细胞生长于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基,置37℃含5%CO2的培养箱中孵育。待细胞生长至亚融合状态时,更换为无血清DMEM培养基使细胞生长同步化24h,然后将细胞分为以下5组:正常对照组(NG, ACT A Ong/ml, FS Ong/ml)、ACT A (AG, ACT A 3ng/ml, 10ng/ml, 30ng/ml,)、ACT A+FS组(AFG, ACT A 3ng/ml+FS100ng/ml, ACT A 30ng/ml+FS 100ng/ml) 24h后收集各组细胞。通过流式细胞术检测细胞的增殖指数,3H胸腺嘧啶摄入法检测各组细胞增殖活性,Westernblot检测各组细胞p-Smad2/3的表达水平。 结果 1.胶质母细胞瘤组织检测 1.1免疫组化检测胶质母细胞瘤ACT A、FS、p-Smad2/3的表达 免疫组化结果显示,ACT A在正常脑组织中有少量表达,在胶质母细胞瘤其表达显著增加(ODs 0.58±0.08 vs 0.20±0.03, p0.05), p-Smad2/3的免疫组化染色显示在胶质母细胞瘤和正常脑组织内均无可检测的表达。 1.2胶质母细胞瘤组织ACTA、FSmRNA的表达 ACT AmRNA在正常脑组织中只有少量表达,而胶质母细胞瘤组ACT AmRNA显著增加(正常脑组织组的3.3倍):FSmRNA在正常脑组织与胶质母细胞瘤组织中的表达无统计学差异(正常脑组织组的1.2倍)。 1.3 Western blot结果显示在胶质母细胞瘤组织中p-Smad2/3的表达水平高于正常脑组织。 2.细胞培养 2.1 ACT A对U87增殖的影响及FS的干预作用 2.1.13H胸腺嘧啶摄入法检测U87的增殖活性 通过3H胸腺嘧啶摄入法探测胶质母细胞瘤的DNA的合成活性来检测胶质瘤细胞株的增殖活性。激活素A(3,10,30ng/ml)导致U87MG株对3H胸腺嘧啶的摄取增加(148.7±5.1%,224.5±5.9%,390.2±8.8%,与正常对照的百分比),并且随着剂量的增加而增加。激活素A(3,30ng/ml)在加入卵泡抑素(100ng/ml)后,U87对3H胸腺嘧啶的摄入明显被阻滞(分别减少了41.3%和137.6%),卵泡抑素不改变U87对3H胸腺嘧啶的摄取。 2.1.2流式细胞术检测激活素对U87增殖的影响 通过流式细胞术检测发现,激活素A(3,10,30 ng/ml)明显提高了U87的增殖指数(与正常对照相比分别提高了6.3±0.5%和27.3±2.5%,36.7±4.2%),在加入卵泡抑素100ng/ml后各组的增殖指数明显降低(分别降低了11.8±1.74%,14.3±1.7%,21.1±2.4%),卵泡抑素自身对U87的增值率无明显影响。 2.1.3激活素A对胶质母细胞细胞ACT受体p-Smad2/3表达的影响 Western-blot结果显示在激活素A的刺激下,胶质母细胞表达激活素的下游信号转导分子复合物p-Smad2/3高于对照组,并且随着激活素A浓度增加而增高。 结论 1、在胶质母细胞瘤U87中存在激活素A/Smad信号蛋白的上调,而激活素A的拮抗剂卵泡抑素的表达却没有相应增加。 2, ACT A能促进胶质母细胞瘤细胞在体外的增殖活性,而卵泡抑素可以阻断ACT A的作用通路,从而消除ACT A对胶质母细胞瘤细胞增殖的促进作用。 3、通过阻断激活素A在胶质瘤中的表达或者阻断它的生物学校应,可能是一个治疗或者延缓胶质瘤发展的途径。


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