喉癌及复发癌微卫星杂合性丢失的研究

【摘要】：【研究背景与目的】 头颈肿瘤在全身肿瘤发病率中占第六位,而喉鳞状细胞癌(简称喉癌)是头颈部常见的恶性肿瘤,其发病率占全身恶性肿瘤的5.7%-7.6%,占头颈肿瘤发病率7.9%-35%,近年来,喉癌的发病率及死亡率均有明显增高趋势,严重威胁着人类健康与生命。尽管目前临床各种手术方式不断改进完善、副反应轻的放化疗方案相继出现,但仍有相当一部分患者喉癌术后发生局部或区域性转移,甚至发生全身转移。喉癌术后复发仍是治疗失败的主要原因,有些报道复发率占50%,复发部位是喉局部,区域淋巴结,远处转移。随着对喉癌研究的深入,对不同类型的喉癌有了更深的了解,对其发展规律及影响预后的因素有了进一步的探讨,使临床治疗方式也发生了变化。而目前对于复发喉癌患者原发癌或复发癌研究较少,尤其是这些所谓的“复发”肿瘤是原发癌复发还是非原发喉癌克隆起源的新生喉癌,一直是一个悬而未决的问题。传统上,临床病理学证据是区分远处转移和第二原发肿瘤的金标准,但是如果病理类型一致,那是复发还是第二原发肿瘤就无法判断。而准确区分所谓的复发肿瘤是原发癌复发还是新生癌是揭示肿瘤发生、发展的规律、最终找到攻克肿瘤的行之有效的方法的前提。 喉及喉咽癌98%以上为鳞状细胞癌,常有颈淋巴结转移,特别是声门上型喉癌和喉咽癌,颈淋巴结转移率高达50%-60%。而传统的颈淋巴结清扫术一直被认为是切除转移的颈淋巴结有效方法。然而,仍有较多颈清扫术后常规病理组织学检查淋巴结阴性的喉癌患者术后复发,其5年颈部复发率为10%-15%,考虑可能与未能切除已存微转移淋巴结或原发灶周围有与之克隆起源不同的第二原发灶有关。这说明常规病理检查手段很难发现以单个细胞或微小细胞团形式存在的微小转移灶或第二原发灶,这些不被一般检查方法发现的隐匿性转移可能是导致复发和转移的主要原因,可能会影响患者术后综合治疗方案的制定,并间接影响了患者的预后。 “生癌野”的假说是指区域内的黏膜上皮细胞虽然外表正常,但因缓慢暴露于致癌因素作用下会事先具备癌变条件,因此在条件改变时促使它们渐变成侵袭性病变,同区域不同位置黏膜病变可能存在时间不同,即可能出现原发灶旁边有卫星第二原发癌,其分布没有特定的位置。淋巴结的微转移不是成簇的,而是分散在整个淋巴结中,在淋巴结中的分布没有一个特定的位置。正是由于微转移位置及可能存在的第二原发灶的位置的不确定性,所以研究中多采用连续切片HE染色观察以提高准确率。Viale等报道,间隔50um连续切片中可以发现18%的微转移,在增加到300um后就会被遗漏掉。Dowlatsha hi等对52例Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者行间隔0.25mmm连续切片及加作IHC,转移的检出率从12%提高到58%。徐世影等统计检出的29个微转移灶最小直径为(1.36±0.85)mm,推荐1mm作为常规可操作的切片间隔。但是,真正的连续切片耗时巨大,一个淋巴结需要多少切面数才能尽量避免遗漏微转移不得而知,无法实际应用于临床。 总之,术后出现再发原因有二：①原发肿瘤未切净或微转移未切净,原发部位或微转移部位发生肿瘤。②原发喉癌治愈的基础上新发的喉癌,喉癌病灶彼此从克隆起源上相互独立。而这些所谓的“复发”肿瘤是原发癌复发还是非原发喉癌克隆起源的新生喉癌,一直是一个悬而未决的问题。由此引起临床认识及治疗方案的混乱,对于原发喉癌是否需扩大切除,即不考虑喉功能以确保切净肿瘤同时切净微转移；还是在肉眼切净肿瘤基础上尽可能保留喉功能。对于再生喉癌,有手术机会的术后如何治疗,失去手术机会的再生喉癌又如何治疗。 由于各学科形成的职业偏见等因素的影响,目前喉癌的综合治疗在临床实践中执行得并不是很好,尤其当喉癌术后复发或发生第二原发癌时严重阻碍患者手术远期疗效,明显降低生存质量。本研究以已复发喉癌患者为对象,初步探讨喉原发癌和术后复发性喉癌的微卫星杂合性丢失,探讨喉原发癌杂合性丢失与复发关系,探讨喉原发癌及术后复发癌之间的关系-是复发还是第二原发癌,并探讨术后复发癌患者的相关治疗与复发的关系,为临床上更合理的治疗喉癌提供有用的理论依据。 第一部分 微卫星杂合性缺失检测再生喉癌克隆起源的研究 【目的】探讨分析同一患者原发喉鳞状细胞癌及再生癌微卫星杂合性缺失(LOH)的模式异同模式,借此区分是原发喉癌复发还是新发喉癌,在此基础上形成理论指导原发喉癌及再生喉癌的规范治疗。 【方法】选取10个多态性微卫星位点D3S1234、D5S592、D9s171、D9s104、D9S162、D3S1300、D8s261、D8S552、TP53、D13S317,以37例手术切除的同一患者喉原发癌和再发性喉癌为主要研究对象,通过激光捕获显微组织切割分别获取肿瘤和癌旁组织,经DNA抽提和利用微卫星PCR-SSCP银染技术,分析原发喉癌及再生喉癌微卫星LOH的模式,推测再生喉癌的克隆起源。 【结果】37例同一患者喉原发癌及再生喉癌中10个微卫星位点发生LOH的频率从22.2%到56.9%。判断克隆起源的标准：对同一病例原发喉癌与再生喉癌的10个微卫星位点进行LOH分析,当信息性位点上LOH模式均相同,判断为原发癌复发；出现不同LOH模式的微卫星位点数目/信息性位点总数大于30%,则判断为再生喉癌；而小于30%则为无法判断克隆起源。本结果显示：对任一患者,其原发癌与再生癌在各个微卫星卫点的LOH模式相同。 【结论】1、选择位于多条染色体(3,5,8,9,13)上的10个微卫星位点,应用PCR-SSCP方法对同一患者原发喉癌与再生喉癌进行LOH分析,根据LOH模式的异同,可以在分子生物学水平上判断再生喉癌的克隆起源。该方法是弥补组织形态学诊断不够准确的理想方法之一。 2、在喉鳞状细胞癌中检出D3S1234、D5S592、D9S171、D9s104、D3S1300位点上LOH超过40%,提示该5个位点更为敏感和特异,可以作为检测LOH首选位点。 3、所选择患者的再生癌与原发癌克隆起源相同。说明初次手术时原发肿瘤未切净或微转移未切净,提示需进行补充治疗,即需进行综合治疗。 4、未发生LOH者术前平均吸烟时间短于发生LOH患者,说明吸烟与LOH发生有关。 5、未检测出LOH者第一次术后平均复发时间长于发生LOH者,说明术后复发与染色体变异有关。 第二部分 复发性喉鳞状细胞癌患者其原发灶微卫星杂合性缺失的研究 【目的】探讨微卫星杂合性缺失(LOH)在复发性喉鳞状细胞癌患者其原发癌的特征及其临床意义。 【方法】选取染色体3p、5p和9p上3个多态性微卫星位点D3S1234、D5S592、D9s171,通过激光捕获显微组织切割分别获取肿瘤和癌旁组织,经DNA抽提和利用微卫星PCR-SSCP银染技术,对已复发的58例原发喉鳞状细胞癌组织及相应癌旁组织进行LOH分析。回顾性分析复发癌患者第一次术后相关治疗与复发的关系。 【结果】3个微卫星标记物LOH发生率分别为48.3%(15/31),45.2%(14/31),61.3%(19/31)。LOH的检出率与第一次术后至复发时间(复发时间)呈负相关,即检出患者术后复发时间短,未检出患者术后复发时间长,两组间差异有统计学意义(P0.05)。两个或两个以上等位基因位点同时发生LOH者术后复发时间短于仅单个等位基因位点发生LOH者,两组间差异有统计学意义(P0.05)。 【结论】1、微卫星杂合性缺失与术后复发时间呈负相关,即术后复发与染色体变异有关； 2、多个等位基因位点同时发生LOH者术后复发时间短于仅单个等位基因位点发生LOH者,即术后复发与染色体变异程度有关,可作为喉癌预测术后复发的参考标志； 3、回顾性分析喉癌术后治疗与复发之间的时间与生存情况,发现喉癌初次术后存LOH者进行化疗+放疗者术后复发时间长于未行治疗者,可有效指导术后临床治疗方案的选择。