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Cytophaga hutchinsonii纤维素降解机制的研究

朱永涛  
【摘要】:以纤维素为主要成分的植物生物质是地球上最丰富的可再生资源。随着石油、煤炭等化石资源的逐渐枯竭,开发新的可再生能源已经成为人们迫切的需求,因此对木质纤维素的高效开发利用越来越受到人们的重视。但由于纤维素自身的特殊性质和目前人们对已知纤维素降解微生物和降解酶认识的不足,只有很少一部分纤维素资源被有效的利用。 自然界中可降解纤维素的微生物多种多样,其降解纤维素的策略也呈现多样性。其中好氧细菌Cytophaga hutchinsonii表现出很强的结晶纤维素降解能力,但其纤维素降解机制尚不明确。该菌可能利用一种既与已知的非复合体型纤维素酶酶系模式,又与复合型纤维小体模式不同的独特纤维素降解机制以实现纤维素的高效降解。因此本文展开了对C. hutchinsonii降解纤维素机理的研究,主要研究了该菌对不同碳源的利用情况,并从生化和遗传角度对其细胞膜相关主要纤维素酶进行了研究,由此提出了该菌降解纤维素的机理模型。本文的主要内容及结果如下: 1.对C. hutchinsonii在不同碳源中的生长、底物消耗与产物形成进行了系统分析,并研究了纤维素酶在细胞中的分布。 研究发现C. hutchinsonii在结晶纤维素和无定形纤维素中生长时,纤维素的利用率和生物量得率都相近;首次在以纤维素为唯一碳源的C. hutchinsonii培养液上清中检测到了少量葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖;同时,研究表明所获得的C. hutchinsonii休止细胞具有酶解结晶纤维素产生纤维寡糖的能力,而且对纤维寡糖也具有很好的水解能力。纤维二糖可以诱导促进C. hutchinsonii纤维二糖和纤维寡糖的利用,使菌体生长延滞期缩短。在建立了C. hutchinsoni细胞分级分离技术的基础上,对纤维素酶的细胞空间分布进行了分析,结果表明结晶纤维素能够显著诱导C. hutchinsonii细胞外膜羧甲基纤维素酶的酶活水平,而纤维二糖则能诱导细胞质膜中纤维二糖酶的活力水平。 2.建立了荧光辅助糖电泳(FACE)技术,并成功地应用于C. hutchinsonii纤维素降解机理的研究。 发现FACE分离胶浓度高于32%时纤维寡糖可以有效分离;同时发现ANTS标记具有较好的温度稳定性,并且可以对纤维素材料如Avicel, RAC和Filter paper等进行标记。因此该技术可以用来分析纤维素酶对纤维素和纤维寡糖的降解产物,并且可以分析纤维素酶对纤维寡糖催化的糖苷键位置。 3.建立了C. hutchinsoni膜相关蛋白提取分离技术,并在此基础上初步建立了用于检测C. hutchinsoni膜蛋白复合物的Blue Native-PAGE技术。 在细胞分级分离的基础上,通过对各种去垢剂的膜蛋白溶解效率及酶活保持能力的分析,确定了基于n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM)的细胞膜相关蛋白提取的技术;并进一步建立了用于检测C. hutchinsoni膜蛋白复合物的Blue Native-PAGE技术,该技术可以保持膜蛋白复合物的活性,并且通过与质谱技术的联用可以鉴定复合物的成分。 4.首次从C. hutchinsoni细胞外膜蛋白中分离纯化到了三个纤维素酶组分,并对其性质进行了研究。 C. hutchinsonii细胞外膜蛋白分别经过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析分离后,获得三个纯化的纤维素酶组份。经质谱鉴定其分别为CHU_1107,CHU_1075和CHU_3384,蛋白分子量分别为136.2 kDa,274.8 kDa和33.8kDa。三种酶对羧甲基纤维素(CMC)反应的最适pH都为5.0,最适温度分别为45℃,40℃和45℃;底物分析结果表明,除CMC外,三种酶还可以降解地衣多糖(Lichenan)和木聚糖(Xylan);同时三种酶对纤维寡糖都有一定降解活性。此外,CHU_1107对再生无定形纤维素(RAC)具有降解活性,而CHU_1075对几丁质(Chitin)有一定的降解活力。去垢剂DDM和TritonX-100对CHU_1107的酶活力有明显的促进作用。 5.在大肠杆菌中表达纯化了CHU_1107和CHU_1075的催化结构域,并对CHU_1107催化结构域(CHU_1107 GH5)的催化特性和催化中心关键氨基酸进行了研究。 纯化获得的CHU_1107催化结构域(CHU_1107GH5)对CMC, Lichenan,聚合度大于2的纤维寡糖(Cellodextrins DP2), RAC,滤纸和结晶纤维素AvicelPH-101都具有降解活性,水解产物以纤维二糖为主;瑞氏木霉CBHI来源的CBM结构域对CHU 1107GH5降解结晶纤维素的能力具有一定促进作用。在以Avicel PH-101进行的水解反应中,CHU_1107GH5可以使Avicel结晶度降低但保持平均聚合度不变,表现出一定的持续性催化特性。进化分析显示其与Saccharophagus degradans持续性催化内切酶Ce15H具有很高的同源性。通过对CHU_1107GH5催化中心保守氨基酸His131, His225和E166N的定点突变分析表明,所有突变体均丧失了相关水解活性,而催化中心周围的芳香族氨基酸Trp61和Trp308可能在酶与结晶纤维素底物结合过程中发挥着重要作用。 6.初步建立了包括转座子随机诱变和基因插入失活的C. hutchinsonii遗传操作体系,并首次在C. hutchinsonii中实现了基因的插入失活。 通过接合转移,以转座子pHimarEm1对C. hutchinsonii基因组进行随机插入诱变,实现了外源DNA向C. hutchinsonii的转移,并由此建立了一个小型转座子突变体库,筛选获得了一些菌落扩散能力增强的突变株。以pHimarEm1为携带载体,实现了来自Flavobacterium johnsoniae的PompA启动子控制的绿色荧光蛋白(GFP)在C. hutchinsonii体内的活性表达。进一步利用自杀型质粒pLYL03实现了对chu_1107基因的插入失活,CHU_1107失活突变株的细胞外膜CMCase和RACase活力与野生型相比明显降低,突变株利用纤维素的能力也有所下降,证明了第五家族糖苷水解酶CHU_1107在C. hutchinsonii降解结晶纤维素过程中发挥着重要作用。


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