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芩丹胶囊对血管外膜成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导通路影响的研究

任敏  
【摘要】:研究背景 心血管的重构贯穿于血管内膜损伤后再狭窄、动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)、高血压等多种心血管疾病的发生、发展过程中,是各种病变维持、恶化的病理结构基础。近年来,血管外膜在损伤后血管重构过程中所起的作用得到了空前的关注。研究证明,外膜对血压升高的反应是最敏感的,并且早于血管中膜和内膜,而且外膜的这种变化是高血压血管结构改变的最早征象之一。血管外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblasts, AF)在血管损伤后发生增殖、迁移、分泌细胞外基质,是参与血管损伤后新内膜形成和血管重塑的重要内容。 转化生长因子β1 (Transforming growth factorβ1, TGF-β1)是迄今为止所发现的功能最为复杂的生长因子之一,被公认为是影响AF生物功能最直接,也是最重要的细胞因子。Smad信号通路是TGF-β1的经典下游信号通路,与众多组织如心肌、肝脏、肺及肾脏等的纤维化密切相关。根据Smad在信号转导中的作用可将其分为三类:(1)受体调节型Smad(Receptor activated Smad, R-Smad),包括Smad 1、2、3、5、8,为Ⅰ型受体激酶的底物,在特定的TGF-β超家族成员的信号转导通路中发挥作用;(2)共同介质型Smad(Common Smad, Co-Samd),主要是Smad4。Smad4被磷酸化后可以与R-Smad形成杂聚体,然后进入细胞核内对靶基因的转录进行调节;(3)抑制型Smad(Inhibitory Smad, I-Smad),包括Smad6、7,可以阻断R-Smad与受体或与Co-Samd的结合,从而对Smad信号通路发挥负调控作用。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是新兴的生物技术,被Science评为2002年十大科学成就之首。RNA干扰是一种由目的基因所对应的小分子双链RNA (Double-stranded, dsRNA)启动的序列特异的基因沉默过程,从而导致相应的mRNA被降解,进而阻断基因的表达。人工合成的siRNA可特异性地抑制哺乳类细胞中内源性或外源性基因的表达,使相应基因保持沉默或休眠状态。SiRNA所诱发的基因抑制具有高效性和高度的序列特异性。 本实验通过观察TGF-β1诱导AF生物活性的改变,并用RNA干扰的方法,研究在外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成中TGF-β1/Smad信号通路的作用机制,且进一步探讨Smad2和Smad3在上述过程中的不同作用。 目的 1.观察TGF-β1对外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成的影响。 2.探讨TGF-β1/Smad信号通路在外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成中的作用机制,并研究Smad2和Smad3在这些过程中的不同作用。 方法 1.体外原代成纤维细胞的培养与鉴定:采用组织贴块法体外原代培养大鼠胸主动脉成纤维细胞。大概3-7天可见细胞从组织块周围爬出;SABC法行平滑肌肌动蛋白-α(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)免疫细胞化学染色鉴定。取第3-8代细胞用于实验。 2.小干扰RNA链的合成、有效浓度的筛选:设计并分别合成3条Smad2和Smad3特异性siRNA,同时合成荧光标记的阴性对照siRNA(FAM-siRNA)1条和Smad2/3非特异性阴性对照siRNA 1条。细胞密度达50%-70%时转染FAM-siRNA。转染后荧光显微镜观察荧光阳性细胞,计算转染效率,根据转染效率选择siRNA和Lipofectamine 2000最佳转染浓度。 3.细胞转染和小干扰有效链的筛选:根据Lipofectamin 2000的转染步骤,用western-blot检测各组siRNA的干扰效率,进行有效链的筛选。 4.MTT法检测细胞的增殖能力:接种细胞,按照说明进行细胞转染,24h后,加入含20 ng/ml TGF-β1的正常培养液,继续刺激24h。于刺激结束前4h每孔加入MTT,然后吸弃上清,加入DMSO,比色。 5. Transwell检测细胞迁移能力:应用6孔板transwell小室行体外迁移实验。细胞分组和处理同前,处理过的细胞消化后用DMEM制成细胞悬液,取0.6 ml悬液以5×105/ml的密度接种于上室,下室中加入1.5 ml含10%FCS的正常培养基。37℃培养6h,将上室内侧附着的细胞用湿棉签擦去,固定,伊红和苏木素染色,倒置显微镜下随意取5个视野进行细胞计数(×100)。 6.实时定量PCR检测相关因子mRNA的表达:细胞处理同前,采用Trizol法提取总RNA,并在PCR热循环仪上将RNA逆转录为cDNA。观察基因沉默和TGF-β1处理后,Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型前胶原肽mRNA的表达。采用2-ΔΔCt方法对mRNA表达进行相对定量分析。 7. Western-blot检测相关因子蛋白的表达:取对数生长期细胞消化计数,转染24h后,加入TGF-β1孵育24h,提取蛋白并定量,western-blot检测p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型前胶原肽蛋白表达。 8.统计学处理所有数据资料均采用SPSS 16.0进行统计处理。实验数据用x±s表示,组间差异采用one-way ANOVA分析和t检验,P0.05为差异有统计学意义。 结果 1.原代细胞的生长形态及鉴定 贴壁3-7d后可见细胞从不同的组织块边缘爬出,取第3代细胞,用α-SMA和Vimentin行免疫细胞化学染色,阳性率达100%。 2.针对Smad2或Smad3的siRNA片段均可以有效下调Smad2或Smad3的表达 SiRNA转染并经TGF-β1刺激后,干扰组Smad2或Smad3蛋白的表达较单纯刺激组下降80%以上。且小干扰具有高度特异性和选择性,即siRNA-Smad3只降低Smad3蛋白的表达,而对Smad2蛋白的表达没有影响,同样siRNA-Smad2只作用于Smad2,而对Smad3蛋白表达没有作用。 3.基因沉默Smad2或Smad3对外膜成纤维细胞增殖影响 (1)与正常对照组相比,TGF-β1刺激组增殖显著增强(P0.01); Smad2基因被干扰之后,细胞增殖较单纯TGF-β1刺激组减弱(P0.01)。基因沉默Smad2能显著抑制成纤维细胞的增殖能力。 (2) Smad3基因被沉默后,细胞增殖能力较TGF-β1刺激组减弱(P0.01)。SiRNA介导的Smad3表达下调可以显著抑制成纤维细胞的增殖。 (3) SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著抑制成纤维细胞的增殖,但两者差异没有统计学意义(P0.05)。 4.基因沉默Smad2或Smad3对外膜成纤维细胞迁移的影响 (1)与正常对照组相比,TGF-β1刺激后细胞迁移能力显著增强(P0.01);下调Smad2基因表达之后,细胞迁移较TGF-β1刺激组减弱(P0.01)。基因沉默Smad2能显著抑制成纤维细胞的迁移能力。 (2) Smad3基因被沉默后,细胞迁移能力较TGF-β1刺激组减弱(P0.01)。SiRNA介导的Smad3表达下调亦可以显著抑制成纤维细胞的迁移能力。 (3) SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著抑制成纤维细胞迁移能力,然而两者之间差别无统计学意义(P0.05)。 5.基因沉默Smad2或Smad3对TGF-β1信号转导通路相关因子mRNA表达的影响 (1)经TGF-β1刺激后,Smad2、Smad3、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达均较正常组显著增强(P0.05或P0.01),而Smad7 mRNA表达则无显著差异(P0.05).SiRNA介导Smad2表达下调后,与TGF-β1刺激组相比,α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达显著降低,差异具有统计学意义(P0.05或P0.01), Smad7 mRNA表达则无显著差异(P0.05)。 (2) Smad3基因被沉默后,α-SMA, I及Ⅲ型前胶原mRNA较TGF-β1刺激组减弱,其差异具有统计学意义(P0.05或P0.01)。Smad7 mRNA表达无显著差异(P0.05)。 (3)SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达,但两者之间差别无统计学意义(P均0.05)。 6.基因沉默Smad2或Smad3对TGF-β1信号转导通路相关因子蛋白表达的影响 (1)经TGF-β1刺激后,Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前胶原蛋白表达均较正常组显著增强(P0.01),而Smad7蛋白表达则无显著差异(P0.05)。SiRNA介导Smad2表达下调后,与TGF-β1刺激组相比,p-Smad2、α-SMA、I型前胶原蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P0.05或P 0.01),Smad7蛋白表达则无显著差异(P0.05)。 (2) Smad3基因被沉默后,p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前胶原蛋白较TGF-β1刺激组减弱,其差异具有统计学意义(P0.01)。Smad7蛋白表达无显著差异(P0.05)。 (3)SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著α-SMA,Ⅰ型前胶原蛋白表达,但两者之间差别无统计学意义(P0.05)。 结论 1.实验中所选用siRNA可以高效并特异地阻断Smad2或Smad3的表达。 2. TGF-β1对外膜成纤维细胞的增殖有促进作用,Smad2和Smad3信号通路共同参与其中。 3. TGF-β1促进外膜成纤维细胞的迁移,这一过程需要Smad2和Smad3的共同参与。 4. TGF-β1诱导成纤维细胞转分化和胶原沉积,是依赖Smad2和Smad3信号转导通路的共同作用。 研究背景 高血压病是严重危害人类健康的常见病和多发病,其发病率逐年升高,目前我国成人发病率高达18.8%。随着对高血压病发病机理的研究和降压药的发展,患者血压水平多能得到有效控制,但高血压所伴发的靶器官损害的发病率、致残率和致死率仍然高居不下。血管重构(Vascular remodeling, VR)既是高血压状态下机体对各种改变的适应性行为,又是高血压病持续发展恶化的重要病理学基础。研究血管重构的发生和逆转机制,对有效控制血压、预防和减轻各种并发症具有非常重要的意义。 血管外膜在高血压血管重构中的作用越来越受到重视,血压升高是促使外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblast, AF)变为肌成纤维细胞(Myofibroblast, MF)的重要因素,后者具有增殖及迁移活性,可由外膜向中膜和内膜下间隙迁移,同时能够促进细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)合成,导致晚期纤维化,管腔缩窄,参与了血管重构。 转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1, TGF-β1)是重要的促纤维化细胞因子之一,可以通过激活一系列的细胞内信号传导通路,引起靶基因的转录。Smad是其主要的细胞内信号转导途径,与众多组织如心肌、肺及肾脏等的纤维化密切相关。 中药血清药理学方法是指给动物灌服中药一定时间后,用其血清进行实验研究的药理学研究方法。这种实验方法不仅体现了药物在生物体内的生物转化,同时克服了中药复方研究中其他因素的干扰。 芩丹胶囊(Qindan capsule, QC)是导师临床治疗高血压病的经验方,有清热平肝、化瘀和络的功效。以前的研究表明该药能够改善SHR大鼠主动脉壁形态学指标,降低主动脉中膜胶原含量,改善SHR大鼠主动脉中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表型改变。但是其对血管外膜及TGF-β1/Smad信号系统的影响尚不明了。本研究探讨了芩丹胶囊对TGF-β1诱导的AF增殖、迁移、表型转化以及细胞外基质合成的影响,并探讨在此过程中TGF-β1/Smad信号转导通路的作用机制,以期为临床防治高血压病血管损害提供更多科学依据。 目的 1.观察芩丹胶囊含药血清对TGF-β1诱导的AF增殖、迁移、平滑肌肌动蛋白-α(alpha smooth muscle actin,α-SM actin)、Ⅰ和Ⅲ型前胶原mRNA和蛋白表达的改变,探讨芩丹胶囊对TGF-β1诱导的AF的生物活性的影响。 2.观察芩丹胶囊含药血清对TGF-β1诱导的AF Smad2、Smad3、Smad7、磷酸化Smad2 (phosphorylation-Smad2, p-Smad2)和磷酸化Smad3 (phosphorylation-Smad3, p-Smad3) mRNA和蛋白表达的影响,探讨芩丹胶囊对外膜成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导通路的作用。 方法 1.芩丹胶囊的制备及质量标准的研究:采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)和薄层层析法(Thin-layer chromatography, TLC),明确芩丹胶囊的有效成分。 2.成纤维细胞的复苏与传代:取出冻存管,快速解冻,用正常培养基悬浮细胞,离心后转移至培养瓶。待细胞长至90%融合时进行传代。 3.芩丹胶囊含药血清的制备:60只健康雄性Wistar大鼠随机分为3组:芩丹胶囊大剂量组(QC大剂量组)给予QC 750mg/(kg·d);芩丹胶囊小剂量组(QC小剂量组)给予QC 150mg/(kg·d);氯沙坦组给予氯沙坦30 mg/(kg-d)。各组均大鼠灌胃给药,最后一日禁食24h,末次给药后1h(氯沙坦组)和2h(芩丹胶囊组)后乙醚麻醉,腹主动脉取血,37℃水浴1 h,3000 rpm离心15min,取上清,过滤除菌,然后在-57℃条件下真空干燥,-20℃保存备用。 4.MTT比色法检测细胞增殖能力:制备细胞悬液,接种于96孔板,各组加入相应血清继续孵育48h,换用含20 ng/ml TGF-β1的培养基诱导24h,在刺激结束前4h加入MTT,弃上清,加入DMSO,振荡,比色。 5. Transwell法检测细胞迁移能力:细胞分组和处理同前,经过处理的细胞被消化,然后用DMEM制成细胞悬液,取0.6ml细胞悬液接种于上室,1.5ml含10%FCS的正常培养基加入下室。置入孵箱内培养6h,取出小室用湿棉签擦内侧的细胞,然后固定染色,计数。 6.实时定量PCR技术检测相关因子mRNA的表达:细胞处理同前,提取总RNA,将RNA逆转录为cDNA。观察芩丹胶囊和氯沙坦含药血清对TGF-β1诱导的Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型前胶原肽mRNA的表达。用2-△△Ct的方法对mRNA的表达进行相对定量分析。 7. Western-blot技术检测相关因子蛋白的表达:细胞分组和处理方法同前,提取蛋白并定量,western-blot检测p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型前胶原肽蛋白表达。 8.统计学处理所有实验数据用x±s表示,数据资料均用SPSS 16.0进行统计处理。组间差异采用one-way ANOVA分析和t检验,设P0.05为有统计学差异。 结果 1.各实验组细胞增殖情况的比较 与正常对照组相比,TGF-β1刺激组的AF增殖活性明显加强(P0.01);各药物处理组增殖与TGF-β1刺激组相比,有非常显著性差异(P0.05或P0.01),其中以氯沙坦组减弱最为显著(P0.01),其次为QC大剂量组(P0.01),QC大剂量组和氯沙坦组较QC小剂量组有显著差异(P0.05)。 2.各实验组细胞迁移数目的比较 TGF-β1刺激组的AF的迁移数目明显多于正常对照组,且差异具有统计学意义(P0.01);经药物处理以后,与TGF-β1刺激组相比,药物组细胞迁移数目均明显下降(P0.05或P0.01)。 3.各实验组细胞Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达的比较 (1) Smad2 mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞的Smad2 mRNA表达显著升高(P0.01);各药物处理组Smad2 mRNA表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降,其中氯沙坦组下降最为显著(P0.01),其次为QC大剂量组(P0.01);QC大剂量组、氯沙坦组与QC小剂量组比较有显著差异(P0.05)。 (2) Smad3 mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad3 mRNA表达显著升高(P0.01);与TGF-β1刺激组相比,QC大剂量组和氯沙坦组Smad3 mRNA表达均显著下降(P均0.05),QC小剂量组差异没有显著性(P0.05);与氯沙坦组相比,QC小剂量组Smad3 mRNA表达差异有显著性(P0.05)。 (3) Smad7 mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad7 mRNA表达没有明显变化(P0.05);与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Smad7 mRNA表达均显著提高(P0.01);QC大剂量组、氯沙坦组与QC小剂量组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。 (4)α-SMA mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组α-SMA mRNA表达显著升高(P0.01);各药物处理组α-SMA mRNA表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降,其中氯沙坦组下降最为显著(P0.01),其次为QC大剂量组(P0.01),小剂量组与氯沙坦组比较差异具有统计学意义(P0.05)。 (5)Ⅰ型前胶原mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达显著升高(P0.01);与TGF-β1刺激组相比,QC大剂量组和氯沙坦组Ⅰ型前胶原mRNA表达均显著下降(P0.05);QC小剂量组与TGF-β1刺激组相比差异没有统计学意义(P0.05)。 (6)Ⅲ型前胶原mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达表达显著升高(P0.01);与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Ⅲ型前胶原mRNA表达均显著降低(P0.05或P0.01);其中氯沙坦组下降最为显著(P0.01),其次为QC大剂量组(P0.01);氯沙坦组与QC小剂量组比较有显著差异(P0.05)。 4.各实验组细胞Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前胶原、Smad7蛋白表达的比较 (1) Smad2蛋白表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad2蛋白表达明显升高(P0.01)。与TGF-β1刺激组相比,各药物组Smad2蛋白表达有所下降(P均0.01);氯沙坦组显著下降(P0.01),且下降幅度大于QC大剂量组与QC小剂量组(P0.05或P0.01)。 (2) p-Smad2蛋白表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞p-Smad2蛋白表达显著升高(P0.01);与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组p-Smad2蛋白表达均显著下降(P0.01);QC大剂量组和氯沙坦组表达低于QC小剂量组(P0.05或P0.01)。 (3) Smad3蛋白表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad3蛋白表达明显升高(P0.01)。与TGF-β1刺激组相比,氯沙坦组表达水平下降最明显(P0.05),其次为QC大剂量组(P0.05)。且氯沙坦组和QC小剂量组相比有显著性差异(P0.05)。 (4) p-Smad3蛋白表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞p-Smad3蛋白表达表达显著升高(P0.01);与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组p-Smad3蛋白表达均显著降低(P0.01);氯沙坦组与QC小剂量组比较差异具有统计学意义(P0.05)。 (5)α-SMA蛋白表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组α-SMA蛋白表达显著升高(P0.01);各药物处理组α-SMA蛋白表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降,其中氯沙坦组下降最为显著(P0.01),其次为QC大剂量组(P0.01);QC小剂量组和氯沙坦组比较有显著差异(P0.01)。 (6)Ⅰ型前胶原蛋白表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刘激组细胞Ⅰ型前胶原蛋白表达显著升高(P0.01);与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Ⅰ型前胶原蛋白表达均显著下降(P0.01);氯沙坦组Ⅰ型前胶原白表达低于QC小剂量组(P0.05)。 (7) Smad7蛋白表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad7蛋白表达没有明显变化(P0.05);与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Smad7蛋白表达均显著提高(P0.01);其中氯沙坦组升高最为显著(P0.01),其次为QC大剂量组(P0.01)。 结论 1.芩丹胶囊能够通过TGF-β1/Smad信号转导通路抑制TGF-β1诱导的AF增殖和迁移。 2.芩丹胶囊能够抑制TGF-β1诱导的AF表型转化,其机制与降低TGF-β1信号因子Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 mRNA和蛋白表达,并升高Smad7 mRNA和蛋白表达上调有关。 3.芩丹胶囊能够抑制TGF-β1诱导的细胞外基质的合成,其机制与降低TGF-β1信号因子Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 mRNA和蛋白表达,并升高Smad7 mRNA和蛋白表达有关。 研究背景 高血压性血管重构是心血管事件的重要危险因素,转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1, TGF-β1),能够激活外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblasts, AF),使之迁移、增殖、表型转变及合成细胞外基质的能力增强,参与高血压性血管重构。 槲皮素(3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone, Que),是自然界中分布最广的生物黄酮类化合物。大量研究已证实槲皮素是一种有效的降压药,同时还具有抗氧化、抗血栓、抗炎、减轻心肌肥厚等多种心血管保护作用。槲皮素是芩丹胶囊中桑寄生的有效成分,我们通过检测槲皮素对TGF-β1诱导的AFs增殖的影响,同时应用荧光实时定量RT-PCR检测Smad2、α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型前胶原mRNA表达情况以及western blot检测Smad2和p-Smad2蛋白表达的改变,探讨了槲皮素逆转TGF-β1诱导的AFs生物活性的机制,为其临床防治高血压性血管重构提供科学依据。 目的 观察槲皮素对TGF-β1诱导的AFs增殖的影响,以及对Smad2、α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型前胶原、p-Smad2 mRNA和蛋白的影响,探讨槲皮素逆转TGF-β1诱导的AFs生物活性的机制。 方法 1.AFs的复苏与传代:液氮罐中取出冻存管,快速解冻,悬浮细胞,离心,转移至培养瓶。待细胞长至90%融合时进行传代。 2.MTT法检测细胞增殖情况:以细胞密度为2×104接种于96孔板,培养24h,换无血清培养基培养4h,使细胞同步生长,吸弃上清,各组加入(6.25μmol/L、12.5μmol/L和25μmol/L)槲皮素预处理细胞24h,换用含20ng/ml TGF-β1的培养基刺激24h,在刺激结束前4h加入MTT,弃上清,加入DMSO,振荡,比色。 3.实时定量RT-PCR技术检测相关因子mRNA的表达:细胞饥饿4h后换用正常培养基,用各浓度的槲皮素预处理细胞24 h后,再给予TGF-β1刺激24h,提取总RNA,将RNA逆转录为cDNA。实时定量RT-PCR检测Smad2、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型前胶原肽mRNA的表达。 4. Western-blot技术检测相关因子蛋白的表达:细胞分组和处理方法同前,提取蛋白并定量,western-blot检测p-Smad2和Smad2蛋白表达情况。 5.统计学处理:所有实验数据用x±s表示,数据资料均用SPSS 16.0进行统计处理。组间差异采用one-way ANOVA分析和t检验,设P0.05为有统计学意义。 结果 1.各实验组细胞增殖情况的比较 与正常对照组相比,TGF-β1刺激组的AF的增殖活性明显加强(P0.01);大、中剂量组增殖与TGF-β1刺激组相比,有非常显著性差异(P0.01),其中以大剂量组减弱最为显著(P0.01),其次为中剂量组(P0.01),小剂量组和刺激组相比没有显著差异(P0.05)。 2.各实验组细胞Smad2、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达的比较 (1) Smad2 mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞的Smad2 mRNA表达显著升高(P0.01);大、中剂量组Smad2 mRNA表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降,其中大剂量组下降最为显著(P0.01),其次为中剂量组(P0.01),小剂量组没有显著差异(P0.05)。 (2)α-SMA mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组α-SMA mRNA表达显著升高(P0.01);大、中剂量组α-SMA mRNA表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降(P0.05或P0.01),小剂量组与刺激组比较差异没有统计学意义(P0.05)。 (3)Ⅰ型前胶原mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达显著升高(P0.01);与TGF-β1刺激组相比,大剂量组和中剂量组Ⅰ型前胶原mRNA表达均显著下降(P0.05);小剂量组与TGF-β1刺激组相比差异没有统计学意义(P0.05)。 (4)Ⅲ型前胶原mRNA表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达表达显著升高(P0.01);与TGF-β1刺激组相比,大、中剂量组Ⅲ型前胶原mRNA表达均显著降低(P0.05);其中大剂量组下降最为显著(P0.05),其次为中剂量组(P0.05),小剂量组没有显著差异(P0.05)。 3.各实验组细胞Smad2和(?)-Smad2蛋白表达的比较 (1) Smad2蛋白表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad2蛋白表达明显升高(P0.01)。与TGF-β1刺激组相比,大、中剂量组显著下降(P均0.01),小剂量组差异没有显著性(P0.05)。 (2) p-Smad2蛋白表达比较:与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞p-Smad2蛋白表达显著升高(P0.01);与TGF-β1刺激组相比,大、中剂量组p-Smad2蛋白表达均显著下降(P0.05或P0.01);小剂量组蛋白表达下降没有统计学意义(P0.05)。 结论 1.槲皮素能够显著抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞的增殖。 2.槲皮素抑制了TGF-β1诱导的成纤维细胞Smad2、p-Smad、α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型前胶原mRNA和蛋白的高表达。 3.槲皮素能够通过TGF-β1/Smad2信号通路改善TGF-β1诱导的成纤维细胞的生物活性的改变。


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10 查佶;黄宇烽;;前列腺癌中TGF-β/Smad信号的研究进展[J];中华男科学杂志;2009年09期
11 王岩;张晾;潘杰;;转化生长因子β1在脑积水发生中的作用[J];现代生物医学进展;2009年19期
12 孙立胜;蒋青;李建新;蒋旭;邵振兴;史冬泉;;硫酸氨基葡萄糖对ATDC5细胞分化和细胞外基质基因表达的影响[J];江苏医药;2011年08期
13 张文岚,孙文伟,卜丽莎,李广生;Smad蛋白家族与骨形态发生蛋白信号传导[J];中国地方病学杂志;2002年04期
14 蔡俊;张柳;;骨形态发生蛋白信号传导系统与成骨细胞分化[J];华北煤炭医学院学报;2007年03期
15 李昕;激活素与骨形成[J];国外医学.骨科学分册;2002年01期
16 王红,侯铁舟,王强,李志丹,李相如,陶虹;氟化物作用下体外培养人牙胚内釉上皮细胞中Smad4表达的变化[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2003年01期
17 孙校男,王先开,娄国强;Smad蛋白与肝纤维化[J];国外医学.流行病学.传染病学分册;2005年04期
18 覃国辉,黄俊,马业新;TGF-β_1及其信号蛋白Smad2,3在大鼠心肌细胞肥大中的作用[J];现代医学;2003年05期
19 秦建军,周清华,覃扬,孙芝琳,赵峰,孙泽芳,王艳萍,易成,朱文;Smad3D和Smad7重组腺病毒载体的快速构建[J];中国肺癌杂志;2003年03期
20 谈博,操红缨;TGF-β的信号转导的调控[J];国外医学.分子生物学分册;2002年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘佳琦;胡大海;张战凤;官浩;折涛;张军;白晓智;;IFN-γ对瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β/Smad信号通路作用的研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
2 刘兵;要晖宇;王晓燕;兰雨;毛宁;杨晓;;造血相关干细胞发育与TGF-β/Smad信号调控[A];中国生理学会张锡钧基金会第十届全国青年优秀生理学学术论文综合摘要[C];2009年
3 杨晓;;TGF-β/Smad信号通路维持心血管系统稳态的生理功能和机制[A];第二届模式生物与人类健康研讨会会议论文集[C];2012年
4 熊杰;卫伟;马兵;夏照帆;李勤;余文林;程飚;;TGF-β1/Smad3信号转导通路对皮肤成纤维细胞调控作用的研究[A];第七届中国医师协会美容与整形医师大会论文集[C];2010年
5 熊杰;卫伟;马兵;夏照帆;李勤;余文林;程飚;;TGF-β1/Smad3信号转导通路对创面愈合作用的活体内研究[A];第七届中国医师协会美容与整形医师大会论文集[C];2010年
6 赵晰;;TGF-β/Smad信号传导通路在肝肾硬化后肾纤维化中的作用机理及中药干预作用[A];第十一届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2010年
7 杨晓;;TGF-β/Smad4信号通路维持组织稳态的生理功能和机制[A];中国药理学会第十一次全国学术会议专刊[C];2011年
8 张庚;李玉花;许先荣;潘庆;陈明显;周颖;李国平;周苹;许琳;;大黄素对肺纤维化大鼠TGF-β_1及smad_(3/7)信号通路的影响[A];首届全国中西医结合重症医学学术会议暨中国中西医结合学会重症医学专业委员会成立大会论文汇编[C];2010年
9 万赞燕;邵佳亮;胡国信;;羟基喜树碱对CCL4诱导的SD肝纤维化大鼠TGFβ1/Smad信号通路的影响[A];江西省中西医结合学会传染病专业委员会成立大会暨首届江西省中西医结合传染病学术会议论文汇编[C];2011年
10 吴发胜;邓鑫;梁健;;胃宁方对胃癌前病变大鼠TGF-β/Smads信号通路的影响[A];第二十二届全国中西医结合消化系统疾病学术会议暨消化疾病诊治进展学习班论文汇编[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 任敏;芩丹胶囊对血管外膜成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导通路影响的研究[D];山东大学;2011年
2 李军;晶状体上皮细胞TGF-β/Smad信号转导通路的研究[D];天津医科大学;2011年
3 姜维娜;TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞Ⅳ型胶原表达过程中MAPK和Smad2通路之间的串话[D];复旦大学;2010年
4 张纨;化浊解毒法对肝纤维化大鼠TGF-β/Smad信号转导通路的影响[D];河北医科大学;2010年
5 熊振芳;蕲艾提取液对肝纤维化大鼠TGFβ-Smad信号转导通路的影响[D];湖北中医药大学;2010年
6 薛箭飞;DEDD与Smad3相互作用负性调控TGF-β介导的生物学活性[D];中国协和医科大学;2009年
7 贺文芳;Smad2在氧糖剥夺再灌注损伤中的表达及其作用机制研究[D];中南大学;2012年
8 龙庭凤;TGF-β/Smad信号传导通路及相关基因在日光性角化病中表达及意义[D];昆明医学院;2010年
9 赵伟;TGF-β1/Smad信号转导途径在糖尿病肺细胞外基质改变中的作用及GLP-1对其干预效应的研究[D];天津医科大学;2011年
10 代继宏;Smad对树突状细胞TGF-β信号传导影响机制的初步研究[D];重庆医科大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李瑶;TGF-β1、TβR及Smad2/3在泡球蚴感染小鼠肝脏中的动态变化[D];新疆医科大学;2010年
2 吴芙蓉;橙皮苷抗大鼠肝纤维化作用及对TGF-β/Smad信号通路的影响[D];安徽医科大学;2011年
3 王秀丹;TGF-β_1/Smad信号通路在哮喘小鼠气道黏液高分泌中的作用[D];遵义医学院;2010年
4 龙素军;异甘草酸镁对大鼠肝星状细胞TGF-β/smad信号表达的影响[D];南华大学;2010年
5 沈需;ADSCs对人胆管瘢痕成纤维细胞TGF-β/smad信号通路的作用及机制[D];昆明医学院;2011年
6 魏绪法;泡球蚴感染中期小鼠纤维化肝组织中TGF-β1/Smad信号通路的表达和意义[D];新疆医科大学;2011年
7 孙旭明;红霉素对TGF-β1刺激HFL-F Smad3及Smad7表达的影响[D];南华大学;2012年
8 苏丽娜;TGF-β1/Smad3信号通路在大鼠肾间质纤维化中的表达和作用及全反式维甲酸的干预[D];广西医科大学;2011年
9 张华;红景天甙对大鼠肝组织TGF-β_1/Smads信号通路的作用[D];重庆医科大学;2011年
10 张艳;黄芪对增生性瘢痕TGF-β1的表达及其Smad3信号途径的影响[D];重庆医科大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 通讯员 俞志新 记者 李水根;骨碎补总黄酮可以促进骨形成[N];健康报;2010年
2 记者 李天舒;先天性心脏病病因被发现[N];健康报;2009年
3 ;探秘烧伤的内源性损伤[N];健康报;2010年
4 上海香料研究所 朱立弘;化妆品用添加剂初乳精华素有待被认知[N];中国化工报;2001年
5 本报特约撰稿人 陆志城;mRNA显示技术为抗凝血药开发助力[N];医药经济报;2003年
6 本报记者 何屹;你到底打了几份工?[N];科技日报;2010年
7 ;从α5(Ⅳ)链mRNA突变分析看Alport综合征基因型和表型关系[N];中国医药报;2003年
8 寿生;用药不当 男性不育[N];大众卫生报;2003年
9 余志平;维生素作用谱新篇[N];中国高新技术产业导报;2002年
10 记者 曹继军 通讯员 赵如江;我科学家首次发现附睾中一种抗菌肽基因[N];光明日报;2001年
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