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核受体RXRγ的表达与上皮—间叶转化及甲状腺乳头状癌浸润、转移的关系

刘志艳  
【摘要】:[研究背景] 甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是人类最常见的内分泌肿瘤。甲状腺乳头状癌预后良好,但仍有10%的病人发生淋巴结复发或者远处器官的转移。尽管乳头状癌淋巴结转移率很高,但能够从肿瘤获得并用于提示淋巴结转移的指标尚未得到广泛认识。前期研究主要关注于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及其在促进血管生成与淋巴管生成中的作用。最近,在胚胎发育过程中发展起来的上皮-间叶转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),被报道在肿瘤的浸润和转移过程中发挥着重大作用。 上皮-间叶转化是在胚胎发育过程中发现的。1982年,Gary Greenburg发现在三维立体胶中培养的角膜上皮细胞可以转化为具有迁移能力的间叶组织,首次提出EMT的概念。组织学上,EMT表现为上皮极性和细胞间黏附缺失。在分子水平上,表现为结构粘附蛋白失表达,如E-cadherin和β-catenin;并获得间叶组织标记的表达,如vimentin和fibronectin。并且,上皮来源的肿瘤细胞向间质性细胞转换以获得向间质侵袭的能力。因而,EMT在上皮性肿瘤浸润和转移的过程中发挥着重要作用。某些逆转上皮-间叶转化的化合物可抑制肿瘤浸润和转移、改善病人的预后和生存质量。迄今为止,EMT被报道与多种肿瘤的高转移率相关,包括前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌和直肠结肠癌。 在甲状腺癌,我们最先提出了肿瘤浸润前沿细胞极性/粘附性消失的概念(loss of cellular polarity/ cohesiveness, LOP/C),表现为肿瘤细胞联系松散、单个排列,未能形成典型的乳头状、滤泡状结构。进一步研究表明,伴有LOP/C的甲状腺乳头状癌,更容易发生甲状腺外浸润和淋巴结转移;LOP/C成分不少于20%的PTC被证明为具有高复发率的中分化甲状腺乳头状癌。根据以上阐述的EMT的特征,占有肿瘤组织相当数量的这部分伴有LOP/C的肿瘤细胞,可以从组织学上解释为上皮-间叶转化。Vasko et al的研究同样发现,在细胞间黏附和沟通中发挥重要作用的蛋白,在甲状腺乳头状癌浸润前沿的mRNA表达降低,但vimentin的表达升高。Asioli et al的最新研究也表明,这类肿瘤具有侵袭性行为和较高的死亡率。 核受体(Nuclear receptors, NRs)是受一系列亲脂类配体调节,这类配体包括类固醇、甲状腺激素、维甲酸和维生素D3。核受体通过与配体的结合来发挥基因活化和翻译后的重要步骤,如磷酸化。并通过与多种信号传导通路的相互作用来实现其功能,如MAPK phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K/Akt)和Wnt信号传导通路。视黄醛衍生物通过与维甲酸受体的结合对肿瘤细胞生长和分化发挥作用,包括维甲酸受体(RARs)和维甲酸X受体(RXRs)。RXRγ是一种维甲酸X受体,有两种异构体,包括α和β。迄今为止,有关维甲酸受体在甲状腺肿瘤组织和细胞系中的表达己有各种各样的报道。前期研究表明,RARs在大部分甲状腺乳头状癌中失表达,但与非肿瘤甲状腺组织相比,9例甲状腺癌中有7例高表达RXRγmRNA,这一结果后来得到许多其他研究者的支持。同时,RXRγ的异常表达被证明与胰腺高分化内分泌肿瘤的高转移率有关。然而,RXRγ的在甲状腺乳头状癌中的表达及其生物学作用尚未明了。本课题拟解决以下几个问题:(1)甲状腺乳头状癌中RXRγmRNA及其蛋白的表达;(2) RXRγ的表达与临床病理资料的关系;(3)甲状腺乳头状癌浸润前沿细胞极性/粘附性消失的临床病理学特点及其免疫组织化学特征;(4)甲状腺乳头状癌中上皮一间叶转化概念的提出。 [方法] 1.将69例甲状腺乳头状癌癌组织及其周围组织用甲醛固定,石蜡包埋,制成HE切片,检测浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降的情况,并用卡方检验或Fisher's精确概率检验检测其与其它临床病理学指标(性别、年龄、癌的大小、甲状腺外浸润、淋巴结转移等)的关系。 2.提取所有病例的甲状腺癌组织及其配对甲状腺非肿瘤组织的全RNA,逆转录成cDNA,用RT-PCR法检测是否有RXRγmRNA的表达。用Taqman的探针和引物,采用real-time PCR法检测RXRγmRNA在甲状腺组织的定量表达,β-actin为内对照。RXRγmRNA在甲状腺乳头状癌癌组织和对应的非癌组织中的差异用ΔΔCt法计算,表示为T/N比(T:肿瘤组织;N:非肿瘤组织)。用卡方检验或Fisher's精确概率检验检测RXRγmRNA的表达与浸润前沿肿瘤细胞极性缺失和/或粘附性下降,及其它临床病理学指标(性别、年龄、癌的大小、甲状腺外浸润、淋巴结转移等、脉管浸润、是否复发)的关系。 3.选取4例高表达RXRγmRNA的甲状腺肿瘤组织及其配对非肿瘤组织,提取各组织中的蛋白质,进行蛋白印迹染色,并对肿瘤与非肿瘤组织中的表达进行比较。 4.选取13例高表达RXRγmRNA的病例,进行RXRγ免疫组织化学染色;另外选取16例具有一定成分LOP/C (20%)的病理,进行TTF-1, E-cadherin,β-catenin和vimentin的免疫组织化学染色;分别对各自的免疫组织化学特点进行病理学分析。 5.分析LOP/C的免疫组织化学特色,并检测其与其他临床病理学指标的关系。 6.用逐步logistic regression分析检测可能导致甲状腺肿瘤浸润、转移的危险因子。 [结果] 1.按照2004年内分泌肿瘤的WHO分类和UICC肿瘤分期,采用双盲法对所有标本的HE切片进行观察总结。低分化甲状腺癌和硬化型PTC被从本研究中剔除。 2. LOP/C位于甲状腺乳头状癌肿瘤浸润前沿。69例甲状腺乳头状癌中,有42例(61.8%)为癌浸润前沿癌LOP/C比例不少于20%,定为阳性组;27例(38.2%)为少于20%,定为阴性组。 3.采用公式2exp(ΔCt tumor-ΔCt normal)计算RXRγ在甲状腺乳头状癌肿瘤组织及其对应的甲状腺非肿瘤组织中的表达差异,并用ΔΔCt进行表示。以T/N比等于1.5为临界值,在69例甲状腺乳头状癌中,有59例(85.5%)表达上调,10例(15.5%)表达下调。甲状腺乳头状癌中RXRγmRNA的高表达具有统计学意义(P=0.011)。40例(95.2%)伴有LOP/C的肿瘤高表达RXRγ表达上调与癌浸润前沿癌LOP/C阳性之间有显著统计学意义(r=0.345,P=0.004)。统计学研究结果表明,RXRγ表达上调的PTC患者,在手术时更容易伴发甲状腺外浸润(r=0.292,P=0.019)、进展期肿瘤(pT3和pT4,r=0.318,P=0.016)和颈部淋巴结转移(r=0.338, P=0.005); RXRγ高表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及临床病理学分期无统计学相关性。免疫组织化学研究表明,非肿瘤甲状腺组织低表达或者不表达,而在甲状腺癌中呈弥漫粗颗粒状表达。LOP/C中RXRγ蛋白的表达略有升高。值得注意的是桥本甲状腺炎的甲状腺滤泡细胞浆中,RXRγ表达明显升高。 4.伴有LOP/C的肿瘤细胞的免疫学特点与同一病例中未伴有LOP/C的肿瘤细胞进行了比较。相比经典型PTC肿瘤细胞核中TTF-1的高表达,16例甲状腺癌中伴有LOP/C的肿瘤细胞均倾向于不同程度低表达TTF-1、或者失表达。伴有LOP/C的肿瘤细胞膜E-cadherin表达减少,而β-catenin在细胞膜上的表达下降,而在细胞浆和细胞核内的表达升高。经典型PTC的vimentin主要表达于细胞浆靠近基底膜侧,而伴有LOP/C的肿瘤细胞则呈广泛强阳性。 5.逐步Logistic回归分析进一步表明,RXRγ高表达是手术时甲状腺乳头状癌高发淋巴结转移的一个独立因子之一。RXRγ高表达的肿瘤手术时伴发淋巴结转移的几率是其他肿瘤的6倍。此外,伴有LOP/C的甲状腺乳头状癌淋巴结转移率是无LOP/C的8倍,而甲状腺外浸润(OR,8.759)和进展期(OR,6.143)甲状腺乳头状癌均被证明为淋巴结转移的独立因子。 [结论] 1.癌浸润前沿癌LOP/C同时与甲状腺外浸润及淋巴结转移相关,而甲状腺外浸润与甲状腺乳头状癌术后复发高度相关,提示癌浸润前沿癌LOP/C可以作为一个组织病理学指标对肿瘤进行预后分析。由于在甲状腺乳头状癌中,RXRγ的高表达与甲状腺外浸润有显著性关联,阻断RXRγ的高表达可以作为治疗侵袭性甲状腺乳头状癌的一个指标。 2. LOP/C的免疫组织化学特征表明,其低表达、或者不表达、或异常表达上皮细胞粘附分子标记物E-cadherin和β-catenin、及间叶组织标记物vimentin,我们因之推测LOP/C的细胞分化程度降低、上皮细胞特性减弱、间质细胞特性增强。该形态主要见于肿瘤浸润前沿,且与肿瘤浸润、转移及复发均呈相关性。所以,我们认为LOP/C是上皮一间叶转化的一个形态学表型,同时也是高危甲状腺乳头状癌的一个形态学特点之一。 3. RXRγ高表达与PTC上皮-间叶转化及肿瘤进展相关。


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