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microRNA在肝细胞中的天然免疫功能研究

苏晨鹤  
【摘要】:目的 微小RNA(microRNA)是一类长度约为22个碱基的小分子非蛋白编码的RNA家族,主要功能是通过与靶基因mRNA3'非编码区不完全的互补结合而导致mRNA降解或翻译抑制,从而在转录后水平调节基因的表达,广泛地参与生物体内与机体生长、发育、疾病发生发展的众多生物学过程。 越来越多的研究发现,microRNA-155(miR-155)参与多种生命活动,包括免疫应答、炎症反应和肿瘤的发生等。在巨噬细胞中,miR-155可以受到聚肌胞苷酸(poly I:C)等多种Toll样受体(TLR)配体以及I型干扰素和一些细胞因子刺激而表达升高,这些预示着miR-155在细菌和病毒的免疫应答中应该发挥着一定的作用。此外,在EB病毒感染的B细胞中,miR-155可以受到LMP1诱导表达升高,并通过靶向PU.1 and IKKs负调核转录因子NF-κB信号通路而维持潜伏期EB病毒的稳定性,而在水疱性口炎病毒感染的巨噬细胞中,miR-155又可以增强1型干扰素信号通路,增强机体对于病毒的清除。 乙肝病毒是一种嗜肝DNA病毒,其感染可导致人类急性和慢性肝炎,急性肝炎中大约有0.5%会死于致命的爆发性肝炎,在成人感染中约有5%发展成慢性肝炎,进一步进展为肝硬化或原发性肝癌。相比HCV与肝细胞miRNA的研究,miRNA影响HBV存在性的研究要滞后得多。直到近期,才陆续出现一些研究表明,miRNA的确在HBV感染肝细胞的复杂过程中发挥作用。鉴于此,我们在肝癌细胞系HepG2中通过两种方式异位表达miR-155,观察肝细胞天然免疫功能的变化,分析其作用机制,并通过体外实验初步研究了miR-155异位表达对于乙肝病毒X基因复制的抑制作用。 方法 1.miRNA表达载体构建:用PCR的方法将miRNA的前体序列从人基因组DNA中扩增出来,插入真核表达载体pcDNA3中,通过酶切分析和DNA序列测定确定连入载体的miRNA序列正确。 2.细胞转染:脂质体转染的方法将miR-155过表达质粒或miR-155模拟物及相应的对照转染入肝癌细胞系HepG2细胞;将PAAV/HBV1.2质粒转入HepG2细胞。 3.MTT法检测miR-155异位表达后HepG2细胞的增殖。 4. RT-PCR方法检测细胞内抗病毒基因和细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1) mRNA和HBV X基因的表达水平。 5. Western Blot方法检测细胞内抗病毒蛋白,细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1),以及细胞内磷酸化的信号转导与转录激活因子1(p-STAT1)和磷酸化的信号转导与转录激活因3(p-STAT3)蛋白表达水平。 结果 1.成功构建了pcDNA3-hsa-miR-155、pcDNA3-mmu-miR-155 pcDNA3-hsa-miR-122、pcDNA3-mmu-miR-451、pcDNA3-hsa-miR-223、pcDNA3-mmu-miR-223等与免疫相关的microRNA过表达载体,并通过酶切和测序的方法证明序列正确。 2.建立了miR-155稳定过表达的细胞系。 3. miR-155过表达的HepG2细胞增殖能力比对照组略强,但二者差异不大。 4.过表达miR-155可以提高HepG2细胞中部分抗病毒基因的mRNA和蛋白水平都有所升高。 5. miR-155过表达引起HepG2细胞内SOCS1蛋白水平下降,但mRNA水平没有明显变化。 6. miR-155过表达引起HepG2细胞内p-STAT1和P-STAT3蛋白水平升高,活化JAK(Janus激酶)/STAT(信号转导子和转录激活子)信号通路。 7. miR-155过表达引起的部分抗病毒蛋白水平升高可以在一定程度上抑制细胞内HBV的复制。 结论 本研究以肝癌细胞系HepG2作为研究对象,发现miR-155过表达后可以通过靶向SOCS1而增强JAK/STAT信号通路,增加磷酸化的STAT1和STAT3表达水平;miR-155表达水平的上调引起肝细胞内部分干扰素诱导抗病毒基因表达升高,而不引起细胞增殖的明显变化;在肝细胞内上调miR-155的表达水平可以在一定程度上增强细胞对于HBV感染的抵抗力,揭示了一种新的miRNA与HBV之间的复杂作用关系,具体作用机制还需进一步探索,但有望和其他药物联合用于HBV的治疗。


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