正常子宫内膜间质细胞对子宫内膜腺癌细胞存活与凋亡的调节

【摘要】：目的： 肿瘤细胞及其周围间质,包括间质细胞、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)、新生血管、炎症细胞以及免疫成份等,构成了调节肿瘤细胞生长、并保护肿瘤细胞免受免疫攻击的微环境。近年来,在恶性肿瘤研究领域,肿瘤细胞和微环境之间的关系已日益引起研究者的兴趣,研究结果表明肿瘤的生长是肿瘤细胞与周围微环境相互作用的结果,肿瘤细胞重塑其周围的基质及血管,以利于其生长和转移。因此,微环境在肿瘤的发生、发展、转移中扮演重要的角色,这种关系的根本机制是细胞细胞和细胞-基质间的相互作用。子宫内膜腺癌来源于子宫内膜腺上皮细胞。已经有研究证实,来自正常子宫内膜间质细胞的细胞因子可以诱导Ishikawa细胞(子宫内膜腺癌细胞株)的分化并抑制其生长增殖,但涉及其中的信号通路目前尚不明确,作用机制尚不清楚,并因为肿瘤细胞与微环境的相互作用以及细胞与细胞间的相互作用而更加复杂化。PI3K (phosphoinositide-3-kinase,磷酸肌醇3激酶)/AKT (protein kinase B,蛋白激酶B)信号通路可以通过Akt的磷酸化来调节肿瘤细胞的增殖、分化以及凋亡,在一系列肿瘤中普遍表达失调,在子宫内膜癌中表现为高表达,参与子宫内膜癌的增殖调控。Survivin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis, IAP)家族中抑制作用最强的一员,在人类各种恶性肿瘤组织,包括子宫内膜癌中广泛选择性高表达。生长因子可通过PI3K/Akt通路激活Survivin基因,而PI3K的抑制可以降低Survivin的水平。抑制Survivin的表达可以减少子宫内膜癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡。MAPK (mitogen-activated protein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)/ERK(extracellular signal-regulated kinases,细胞外信号调节激酶)/Survivin信号通路也参与调节细胞的增殖和分化。有研究表明在子宫内膜癌中可以发现ERK的过度激活。本研究的目的在于探索正常子宫内膜间质细胞对子宫内膜腺癌细胞的存活及凋亡的调节作用及其可能的相关机制。 方法： 本研究建立了原代正常子宫内膜间质细胞和子宫内膜腺癌细胞株Ishikawa细胞的2D-共培养系统以模拟子宫内膜癌中间质细胞-肿瘤细胞间的相互作用,并在细胞培养中引入雌孕激素、特异性PI3K抑制剂LY294002以及特异性MAPK抑制剂U0126进行干预实验,以检测正常的子宫内膜间质因子对于子宫内膜癌细胞中Survivin的表达的影响,并探讨在这种间质-肿瘤细胞相互作用中可能会涉及的信号通路。 1、标本收集及细胞培养：用于细胞分离培养的正常子宫内膜组织来自12位行双侧输卵管结扎术的月经规律的育龄期妇女,所取内膜均处于增生期,手术前6个月内没有接受过激素治疗。标本采集前获得患者知情同意。使用胶原酶IA消化分离子宫内膜组织得到正常子宫内膜间质细胞,并通过免疫细胞化学方法使用波形蛋白抗体对其进行鉴定。 2、条件培养基的制备：应用1-2代正常间质细胞进行该实验。将间质细胞接种于铺有Matrigel胶的24孔板,于2ml含有2%的木炭条吸附胎牛血清的无酚红DMEM/F12(称为基础培养基,basic medium, BM)中进行细胞培养,5天后收集细胞培养上清液、离心,作为NSC条件培养基备用。将HELF细胞接种于铺有Matrigel胶的24孔板,于2ml基础培养基中进行培养,5天后收集细胞培养上清液、离心,作为HELF条件培养基备用。 3、MTT检测：使用MTT法测定Ishikawa细胞的增殖情况。将肿瘤细胞悬液接种于96孔平底培养板,细胞贴壁后,加入不同处理因素。5天后,加入MTT工作液,使用微量酶标仪测定570 nm波长的光吸收值。 4、克隆形成实验：Ishikawa细胞接种于12培养孔板,细胞贴壁后,加入不同处理因素。培养5天,将细胞固定、染色后观察细胞克隆数。超过75个细胞的群落计数为阳性。 5、免疫细胞化学和免疫组织化学：将置于培养皿中获得的Ishikawa细胞爬片用于免疫细胞化学检测。4%多聚甲醛固定半小时,TritonX-100作用20分钟,然后用0.3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,加入兔抗人Survivin作为一抗,孵育2小时后,加入HRP标记的二抗。使用DAB作为底物进行显色反应。进行免疫组化检测的组织样本包括正常子宫内膜(21例)和子宫内膜腺癌组织(20例)。石蜡包埋后,切片、脱蜡、水化,用3% H2O2阻断内源性过氧化物酶的活性,微波修复抗原,用10%正常羊血清封闭30分钟,加入兔抗人survivin一抗孵育过夜。然后加入HRP标记二抗。使用DAB作为底物进行显色反应。根据腺上皮细胞阳性染色的百分比和染色强度来进行免疫组化评分。免疫染色评分=阳性染色细胞百分比得分×染色强度得分。 6、Western Blot分析：使用胰蛋白酶消化及低温离心收集细胞。使用全细胞蛋白提取试剂盒获得全细胞裂解物。将蛋白提取物电泳、转膜,将膜于封闭液中孵育1小时,一抗孵育过夜,二抗中孵育1小时。使用ECLPlus Western发光剂显影,应用AlphaImager2200凝胶图文分析软件系统进行免疫印迹光密度分析。 7、ELISA:将Ishikawa细胞接种于24孔平底板。将细胞进行不同的干预后,获得细胞裂解液,顺序加入一抗、二抗、底物及终止液,读取对450nm波长的光吸收值。 8、统计分析：所得数据利用SPSS11.5软件进行方差分析。结果采用均数±标准差的形式表示。用方差分析进行两组间或多组间比较,以p0.05值认为有统计学意义。 结果： 1、MTT和克隆形成实验显示,17β-雌二醇与甲羟孕酮(E+P)联合干预明显促进Ishikawa细胞的增殖(p0.01)。免疫组织化学和免疫细胞化学分析结果表明,Survivin在子宫内膜腺癌中的表达显著高于其在正常子宫内膜中的表达。Ishikawa细胞中Survivin的免疫染色强,并且主要位于细胞核。免疫印迹分析表明,E+P联合作用使得Survivin在Ishikawa细胞中的表达显著增加。MTT试验、克隆形成实验、免疫印迹分析分析结果表明,LY294002(特异性PI3K抑制剂)可显著抑制Ishikawa细胞的基础细胞增殖和激素诱导的Ishikawa细胞的增殖(p0.01),也可显著降低基础的和激素诱导的Survivin表达和Akt磷酸化(p0.01)。MTT试验、克隆形成实验、免疫印迹分析、ELISA分析结果表明,U0126(特异性MAPK抑制剂)同样可显著抑制Ishikawa细胞的基础细胞增殖和激素诱导的Ishikawa细胞的增殖(p0.01),同时也可显著降低基础的和激素诱导的Survivin表达和ERK的磷酸化(p().01)。相关性分析表明,Akt磷酸化(R2=0.916,p0.001)、ERK磷酸化(R2=0.371,p0.001)、以及Survivin表达(R2=0.758,p0.001),均与Ishikawa细胞的细胞增殖呈正相关。以上结果表明,17β-雌二醇与甲羟孕酮联合作用通过激发细胞生存信号通路而促进Ishikawa细胞增殖。 2、MTT试验和克隆形成实验显示,含正常子宫内膜间质细胞的条件培养基不仅降低了Ishikawa细胞的基础增殖(p0.01),而且也有效地消除了激素诱导的细胞增殖(p0.01)。而含HELF的条件培养基对Ishikawa细胞没有生长抑制作用。来自正常子宫内膜间质细胞的分泌性因子可以抑制基础的和激素诱导的Ishikawa细胞的生长增殖,其作用具有特异性。 3、免疫印迹分析数据显示,含正常子宫内膜间质细胞的条件培养基使Ishikawa细胞中Survivin的表达降低了23%,并导致激素诱导的Survivin表达下降了82%。因此,来自正常子宫内膜间质细胞的分泌性因子可以抑制Ishikawa细胞中Survivin的表达。 4、应用免疫印迹检测结果表明,加入含正常子宫内膜间质细胞的条件培养基后,Ishikawa细胞中基础的AKt磷酸化和E+P刺激的AKt磷酸化均有下降(p0.01),然而,ERK的磷酸化未受影响(p0.05)。正常子宫内膜间质因子引起的Ishikawa细胞增殖抑制和Survivin表达降低是由PI3K/AKt信号通路而非MAPK/ERK信号通路介导的。 结论： 1、在子宫内膜癌Ishikawa细胞中存在PI3K/AKt/Survivin信号通路和MAPK/ERK/Survivin信号通路,雌孕激素联合作用通过这两种途径均可以促进Ishikawa细胞的增殖。 2、PI3K抑制剂和MAPK抑制剂均能抑制E+P诱导的和基础的Ishikawa细胞生长,表明PI3K/AKT信号通路和MAPK/ERK信号通路对E+P刺激子宫内膜腺癌细胞生长过程至关重要。 3、Survivin基因的表达与E+P干预下Akt的磷酸化和ERK的磷酸化成正相关。 4、正常子宫内膜间质细胞的分泌性因子可下调Ishikawa细胞中E+P诱导的细胞增殖,同时也能下调E+P诱导的PI3K/AKt/Survivin信号活性。这表明,来自正常子宫内膜间质的分泌性因子能够通过调节细胞的存活和凋亡信号这一途径,来抑制在体外由雌激素-孕激素诱导的Ishikawa细胞的生长。 5、来自正常子宫内膜间质细胞的条件培养基可以明显地抑制E+P诱导的Akt磷酸化和Survivin的表达,而对ERK的磷酸化没有影响,这提示分泌因子可能通过调节Ishikawa细胞中PI3K/AKt/Survivin途径的活性,而非MAPK/ERK/Survivin通路,从而抑制E+P诱导的细胞增殖作用。 6、子宫内膜间质细胞的分泌性因子对子宫内膜癌细胞的调节作用具有特异性。