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血管内皮生长因子改善APP转基因小鼠认知功能的作用及机制研究

王萍  
【摘要】:第一部分 血管内皮生长因子对APP转基因小鼠认知功能的改善 研究目的: 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)导致老年人痴呆最常见的原因,主要临床表现为进行性认知功能减退。对于AD目前尚无根治方法。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是最强的血管生成因子,与VEGF受体结合后可诱导内皮细胞增值、迁移和生长,并形成血管网。近年来研究发现VEGF具有神经营养和神经保护作用,在AD的神经病理及临床症状的进展中均存在VEGF的紊乱。AD患者血清及脑内有效VEGF水平较正常老年人明显减低,携带2578A VEGF、-1154G/G VEGF连锁基因可增加散发性AD的患病风险,表明VEGF在AD的发生、发展中具有重要作用。然而,给予VEGF干预是否能改善AD认知功能障碍,起到神经保护作用,目前尚无报道。 材料与方法: 1.实验动物及给药 APPV7171转基因小鼠共36只,分为对照组和VEGF治疗组,每组18只,VEGF治疗组给予VEGF (8ug/kg. d)腹腔注射连续3天,对照组给予同等体积PBS腹腔注射3天。各组动物分为7、14、28天组,每个时间点6只小鼠。 2行为学检测 利用Morris水迷宫,各组小鼠分别于给药前及给药后第7天、14天、28天进行行为学测试。观察并记录小鼠寻找并爬上平台的路线图、所需时间(逃避潜伏期)。然后将平台撤除,进行空间探索实验,记录60s内小鼠在池中的游泳路线,并计算60s内小鼠在原平台所在象限的游泳时间百分比及穿越原平台所在位置次数。 结果: 1、应用VEGF前,VEGF治疗组与对照组小鼠逃避潜伏期相仿(VEGF治疗组62.26±22.07 s,对照组60.98±17.11s,P0.05)。给予VEGF干预后,与对照组比较,VEGF腹腔注射组APP转基因小鼠认知功能明显改善,小鼠逃避潜伏期缩短,这种改善在治疗后7天即可出现(VEGF治疗组30.91±12.30s,对照组46.07±7.21 s,P0.05),14天时效果明显(VEGF治疗组24.95±10.40s,对照组43.03±11.70 s,P0.01),可持续到第28天(VEGF治疗组25.68±8.38 s对照组45.54±9.55 s,P0.01) 2、APP转基因小鼠搜索平台的策略共有三种方式:空间策略、系统搜索策略、重复环绕策略、。给予VEGF干预后,两组小鼠搜索策略有明显差异,三种搜索方式虽然均被两组小鼠采用,但是对照组小鼠应用相对较高比例的重复环绕策略(7天点21%,14天点29%,28天点21%),各时间点空间搜索策略采用相对固定占29%-33%;系统搜索策略采用分别为:7天点46%,14天点38%,28天点50%)。而VEGF治疗组小鼠搜索策略以空间策略为主,各时间点均占较高比例(7天58%,14天63%,28天67%),部分为系统搜索策略(7天和14天为33%,28天为29%),较少小鼠应用重复循环策略(7天为8%,14天和28天为4%)。卡方检验,各时间点VEGF治疗组和对照组具有显著性差异。 3、撤离平台后,VEGF治疗组小鼠较对照组穿过原平台所在位置次数在第7天(对照组3±2.61,VEGF治疗组4±2.1,P0.05)无明显增加。14天时,治疗组小鼠穿过原平台所在位置的次数明显增加(对照组2.67±2.16,VEGF治疗组6.5±1.64,P0.05),与对照组相比,具有统计学意义。28天时两组差异较14天略有减少(对照组2.83±1.33,VEGF治疗组5.83±1.72,P0.05),但仍具有统计学意义。比较两组小鼠在原平台象限游泳时间百分比发现,7天时,二者相比无明显差异(对照组33.33±7.96%,VEGF治疗组33.33±7.23%,P0.05);14天时差异明显(对照组31.95±15.93%,VEGF治疗组53.89±21.72%,P0.05);28天时差异有所缩小(对照组32.78±4.79,VEGF治疗组49.72±18.15,P0.05),仍具有统计学意义。 结论: 给予VEGF干预APPV717I转基因小鼠可明显改善小鼠的认知功能,其改善作用从用药后7天出现,可持续到28天。 AD的发病机制目前尚不十分清楚,近年来,临床影像学、流行病学和药物学研究发现,血管损害在AD的发病中起重要作用。AD患者的脑血流量明显减少,脑毛细血管普遍狭窄,尤其在靠近老年斑附近。脑血管损伤与A日沉积相互作用,一方面Ap在血管壁及血管周围神经毡的沉积可损伤脑血管,另一方面脑血管损伤、脑血供不足可导致Ap经血管清除减少,形成恶性循环。VEGF是最强的血管生成因子,在AD发病早期,VEGF表达增加可对抗血管缺乏和低灌注。但随着AD的发展,VEGF不断在Ap斑块周围沉积,VEGF与Ap斑块紧密结合。最终导致局部VEGF缺乏,损伤其神经保护功能即血管再生。这些结果提示在AD病人中有效VEGF减少。因此,进一步探讨VEGF对APP转基因小鼠神经保护作用机制是否与促进脑内血管再生,改善脑循环有关,具有重要意义。 材料与方法: 1.实验动物及给药 APP7V’7,转基因小鼠共36只,分为对照组、vEGF治疗组2组,每组81只,VEGF治疗组给予VEGF(sug/kg.)d腹腔注射连续3天,对照组给予同等体积PBS腹腔注射3天。给药同时,各组动物给予BdrU(50mg/kg·d)腹腔注射,连续10d。各组动物分为7、14、28d三个时间点亚组,每个时间点6只小鼠,分别于给药结束后第7、14、82天经眼眶后静脉丛取外周血,并处死取脑。 2.流式细胞学检测 各组小鼠在给药后7天、41天、82天处死前,经眶后静脉丛取血。EDI,A抗凝,流式细胞学AFCS法检测外周血CD3+4细胞,并计算和比较各组小鼠各时间点CD3旷细胞占白细胞百分率。 3.脑标本采集 在给药后7、14、28天将每组各时间点取3只小鼠给予01%水合氯醛(0.398/gk)腹腔注射,麻醉成功后,4%多聚甲醛灌注,直到四肢僵直,取脑。将脑组织放入4%多聚甲醛后固定02小时,依次移入02%和03%蔗糖溶液中各24小时。放入冰冻切片机,经海马制作厚为51pm的冠状切片,用于免疫组化检测。 4.免疫组化检测 冰冻切片,室温放置复温,行vWF免疫组化染色、CD34免疫荧光染色及CD34/VEGFR一2、vWFV/EGFR一2、vWF/BrdU荧光双标检测。结果: 2.1vEGF诱导APP7V’7,转基因小鼠脑内血管新生在各组小鼠均有vWF阳性血管表达,但对照组小鼠表达数量较少,其中海马区vWF阳性血管数各时间点分别为:7天,2.67士0.71;14天,2.44士0.88;28天,2.33士1.00;皮层各时间点分别为:7天,6.33士1.41;14天,6.11士1.66;28天,5.88士1.27。给予VEGF干预后,与对照组相比,VEGF治疗组APP转基因小鼠海马区及皮层vWF染色阳性血管均明显增加。7天VEGF治疗组小鼠vWF阳性血管数海马区为6.00士0.87,皮层为14.55士1.66,较对照组均有显著性差异P(0.50),41天两组比较差异更加明显(VEGF治疗组:海马区01.11士1.45,皮层16.22士1.99;对照组:海马区.244士0.88,皮层6.11士1.66;尸0.10),具有统计学意义。在82天时,VEGF治疗组vWF阳性血管逐渐下降,在海马区,VEGF治疗组:3.44士1.42;对照组:2.33士1.00;P0.50,与对照组无明显差异,而皮层区,VEGF治疗组:9.77士1.20;对照组:5.88士1.26;P0.05,二者比较具有显著性差异。在VEGF干预后14天,治疗组小鼠皮层及海马区均可检测到BrdUv/WF双阳性血管,提示VEGF可促进小鼠皮层及海马区血管新生,而对照组则无明显的血管增生。在小鼠脑内我们观察到vW/FVEGFR一2双阳性细胞,说明VEGF通过VEGFR一2发挥诱导血管新生作用。 应用VEGF治疗后41天,小鼠皮层及海马区存在CD34阳性细胞表达及CD34/VEGFR一2双阳性细胞,表明VEGF干预后可促进内皮祖细胞增殖。2.2VEGF促进外周血CD43阳性细胞增殖流式细胞学技术检测,应用VEGF干预APP转基因小鼠7天后,小鼠外周血CD43阳性细胞百分比较对照组(VEGF治疗组:1.40士0.98%;对照组:.007士0.30%;P0.05)明显增加,约为对照组的巧倍,二者相比具有统计学差异,且在14天达到高峰(VEGF治疗组:1.06士.039%;对照组:0.60士.003%;P0.05),然而,在82天时,CD34阳性细胞百分比明显下降,与对照组相比无明显差异(VEGF治疗组:0.25土0.10%;对照组:0.09士0.07%;P0.05)。 结论: 1.腹腔注射vEGF可促进APP7V‘7,转基因小鼠皮层及海马区血管新生,其作用在用药后7天即可出现,在14天作用最明显。在用药后82天,VEGF促进血管新生的作用下降,以海马区尤为明显。 2.vEGF促进APP7V’7,转基因小鼠脑内血管新生是通过vEGFR一2实现的。 3.vEGF能动员AD动物模型APP7V’7,转基因小鼠外周血cD43阳性细胞增殖,并促进EPCS向皮层及海马区定向迁移。 第三部分血管内皮生长因子对APP转基因小鼠脑内ChAT表达及Aβ沉积的影响 研究目的: AD的特征性病理改变为胆碱能神经元减少和Aβ沉积。临床及临床前研究表明胆碱能缺乏可导致AD认知功能障碍。在AD病人的额叶中部和颞叶上部皮质、内嗅区皮质和海马后脚存在胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶活性减低。胆碱能神经元丢失,尤其在Meynert基底核区,可引起海马区及新皮层突触前胆碱功能障碍。Aβ产生和清除失衡是AD的关键因素,Aβ1-42较Ap1-40易聚集,从而其毒性作用强于后者。为进一步观察VEGF的作用机制,我们检测脑内ChAT表达及Aβ沉积的影响。 材料与方法: 1.实验动物及给药同前 2.脑标本采集 免疫组化检测脑标本采集同前。 每组小鼠每个时间点取3只,麻醉成功后,快速取脑,冰生理盐水冲洗,用纱布包裹,置入液氮快速冷冻后,移入-80℃冰箱保存备用。 3.免疫组化检测 取冰冻切片,室温复温后,进行Aβ1-42及ChAT免疫组化染色。观察皮层、海马及血管壁Aβ1-42沉积及基底核区ChAT的表达情况。 4.Western blot检测 将脑组织匀浆,提取蛋白。Western blot方法检测基底核ChAT的表达。 结果: 1.与对照组相比,VEGF干预后,小鼠NBM区ChAT阳性细胞数有所增加,且用药后7天即有所差异,随着时间延长,这种差异更加明显,在28天时,治疗组和对照组比较具有显著统计学差异。Western blot(?)(?)显示用药7、14、28天后基底核区ChAT表达增加。绝大多数ChAT阳性细胞同时表达MAP-2阳性。Western blot亦显示用药7、14、28天后基底核区ChAT表达较对照组明显增加,其结果与免疫组化染色一致。 2.对照组小鼠皮层、海马区均有较多Aβ1-42沉积,应用VEGF干预后,APPV717I转基因小鼠皮层及海马区Aβ1-42沉积明显减少。小鼠血管壁亦有Aβ1-42沉积,尤其在对照组小鼠脑内部分血管壁沉积明显(图6),应用VEGF14天后小鼠脑内Aβ1-42沉积血管数有所减少。与对照组相比具有统计学意义。而在用药后7天和28天,VEGF干预组小鼠脑内Aβ1-42沉积血管数较对照组无明显差别。 结论: 1. VEGF干预对APP转基因小鼠胆碱能神经元具有神经保护作用,可增加APP转基因小鼠脑内ChAT表达。 2. VEGF干预可减少APP转基因小鼠皮层、海马及血管壁Aβ1-42沉积,其作用在用药后14天最为明显。


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