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一.EphB4通过TGF-β信号通路抑制移植静脉血管内膜增生的机制研究 二.慢性下肢静脉功能不全术后回顾性分析研究

吕伟  
【摘要】:研究背景和目的 在冠状动脉及外周动脉搭桥术中,静脉是最常用到的。静脉置于高压力、高流速的动脉环境中后,静脉慢慢适应于动脉环境的这个过程被称之为“静脉动脉化”或“静脉适应”。成功的静脉适应是一个复杂的过程,包括细胞的增殖和迁移、程序性细胞死亡、细胞外基质的产生和降解以及生长因子协调作用,这一系列的改变最终可导致血管壁的增厚。 人体静脉移植的历史是很曲折的,因为病人的静脉移植取材由于伦理问题通常不能很好的开展;另外,静脉移植成功的报告也很少。虽然静脉移植模型在体外体内能够很好地建立,但是对于接受搭桥手术的老年患者来说,此复杂过程所特有因素的调节机制还不是很清楚。同样,如上所述,许多体外模型也只是研究动脉内皮对剪切应力的反应,而不是静脉内皮对之的反应。 随着发育生物学的不断进展,已经发现动脉和静脉内皮存在着遗传效应,并且明确了动脉和静脉之间分子水平上的差异。基因如何在静脉移植适应过程中发挥作用正在开始被研究;但是在成年和年老动物中,有很少的数据能够表明动、静脉标志物所产生的调节作用。Ephrin配体和Eph受体是一组重要的区分动、静脉的信号分子,其中,Ephrin-B2是一种动脉内皮和平滑肌的标志物并且一直持续存在至成年期;相反,Eph-B4是酪氨酸激酶受体,是静脉内皮和平滑肌的标志物。原先的研究显示,Eph-B4可以抑制移植静脉血管内膜的增厚,但是其调控静脉血管重塑和抑制内膜增厚的分子机制仍然不清楚。 TGF-β信号通路在细胞生长、分化、凋亡、自稳和其他细胞功能中起十分重要的作用。与EphB4类似,TGF-β信号通路在移植静脉的内膜增厚和纤维化过程中也起重要作用。我们的研究目的就是想探究EphB4和TGF-β信号通路之间在移植静脉内膜增厚过程中可能存在的联系。 方法: 1.动物模型实验:建立静脉移植动物模型; 2.细胞培养实验:由于小鼠肺内皮细胞(MLEC)的EphB4表达阳性,所以我们使用这种细胞作为移植静脉内皮细胞模型; 3.激活实验:在不同时间点用Ephrin-B2/Fc配体激活MLEC中的EphB4受体; 4.蛋白印迹法:通过Smad2(是TGF-β信号通路的可溶性蛋白激酶)磷酸化表达来评估TGF-β信号通路的活化情况; 5.抑制物预处理实验:MLEC用P13K通路抑制剂wortmannin和MEK1抑制剂PD-98059等预处理; 6.免疫荧光实验:在移植静脉组织上分析TGF-β受体和Smad2磷酸化表达; 7.统计数据用one-way ANOVA分析。 结果: 1.在不同时间点用TGF-β刺激MLEC后,可看到Smad2磷酸化表达呈一个峰值; 2.在不同时间点用Ephrin-B2/Fc刺激MLEC后,可看到Smad2磷酸化表达呈两个峰值,分别位于5分钟和60分钟两个时间点上; 3.在不同时间点用Ephrin-B2/Fc刺激事先用wortmannin(10nM)预处理后的MLEC,可以看到Smad2磷酸化表达的后一个峰值消失,而前一个峰值不受影响; 4.在不同时间点用Ephrin-B2/Fc刺激事先用U0126(25uM)预处理后的MLEC,可以看到Smad2磷酸化表达的前一个峰值消失,而后一个峰值不受影响; 5.在5分钟的时间点用Ephrin-B2/Fc刺激MLEC后,加入剂量递增的抑制剂PD-98059,与只用Ephrin-B2/Fc刺激的情况相比,Smad2的磷酸化水平没有改变; 6.在不同时间点用TGF-β1、Ephrin-B2/Fc分别刺激MLECs后,观察Akt、 p44/42MAPK (Erkl/2)磷酸化水平均未看到双峰表现; 7.免疫荧光显微镜下观察移植7天后移植静脉组织,可看到Smad2磷酸化、EphB4和TGF-β表达水平较移植前增加。 结论: 1.与TGF-β不同,EphB4信号通路活化后刺激Smad2磷酸化表达呈奇特的双峰分布; 2. Smad2磷酸化表达的后一个峰值可以被PI3K通路的抑制剂Wortmannin所抑制,表明其受多点调控; 3.这些结果表明EphB4调控移植静脉内膜增厚的过程可能存在一个新的分子机制。 研究背景和目的 慢性下肢静脉功能不全(lower extremity chronic venous insufficiency)是临床常见疾病,静脉曲张(varicose veins)是其最主要的症状表现。世界上有高达25%的女性和15%的男性发病,尤其在50岁以上的人群中大约有50%的人患有此病。在中国,此病的发病率大约为8.89%。近几十年来,发病率持续上升,所以下肢静脉功能不全已成为现如今最常见的血管疾病之一。 下肢静脉功能不全的早期症状包括下肢浅表静脉迂曲、扩张。当病人站立时出现疼痛,但当其卧位或走动时疼痛反而消失。在疾病发展过程中,由于血液循环的障碍,下肢皮肤会出现营养障碍,包括皮肤的萎缩、脱皮、瘙瘁、色素沉着、表皮及皮下组织出现硬结,也可形成溃疡和湿疹,尤其是在小腿及足背处。 下肢静脉功能不全最有效的治疗方法仍然是外科手术治疗。大隐静脉高位结扎、剥脱(greater saphenous vein high ligation and stripping),交通静脉结扎(the perforating veins ligation)已成为治疗下肢静脉功能不全的主要手术方式。然而,在长期的随访过程中术后复发率仍相当高(从7%到65%不等)。Sarin等报道大隐静脉结扎剥脱术后3个月左右大约有18%会出现大隐静脉返流,然而单独进行大隐静脉结扎会有45%出现大隐静脉返流。同样的,Dwerryhouse等发现进行大隐静脉结扎剥脱术后复发率为29%,单独行大隐静脉结扎后复发率为71%。然而其复发的原因却很少报道。 我们这篇文章的主要目的就是探寻下肢静脉功能不全术后复发的原因。我们提供了术后复发的92个病例共109条下肢,分析他们的临床表现及影像资料从而寻找潜在的复发原因。 研究方法 我们选取从2005年8月到2011年8月在山东省立医院就诊的92名患有慢性下肢功能不全并术后复发的病人。搜集的资料包括临床表现、症状及影像结果(包括彩色多普勒超声检查和下肢静脉造影)。 结果 根据CEAP分级将92名患者的109条下肢进行分类,其中有37条(34%)属于4级,40条(37%)属于5级,32条(29%)属于6级。101条下肢(92.7%)出现交通支静脉返流,86条下肢(79%)出现浅表静脉的返流,其中轻度返流有5条(22.8%),中度返流有40条(37%),重度返流有21条(19%)。有4条下肢无瓣膜(3.67%),82条下肢(75%)出现GSV残留,19条肢体(17.4%)出现深静脉血栓形成后综合征(post-thrombotic syndrome,PTS),1条下肢(0.9%)为KTS综合征(Klippel-Trenaunay syndrome),2条下肢(2.8%)为髂静脉受压综合征(Cockett syndrome)。 结论 我们的研究表明,交通支静脉未结扎或结扎不彻底、未进行适当的外科手术干预,以及病人静脉本身存在的潜在病因可能是大隐静脉曲张术后复发的主要原因。为了减少术后复发率,我们应对此类病人进行更为细致的影像学检查,以便选择更适合的手术方式进行治疗。


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