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乙酰肝素酶促进骨生成和骨折愈合的实验研究

杨永良  
【摘要】:目的及研究背景 骨质疏松及伴随的骨折是病人致残和致死的重要原因。乙酰肝素酶(HPSE),一种促进血管生成的因子,特异地降解广泛存在于细胞表面和细胞外基质中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖,参与多种恶性肿瘤转移过程中血管生成。尽管如此,它在促进骨生长中的作用仍然不清楚。本实验的目的:1.探讨HPSE在刺激成骨细胞,促进成骨细胞增殖、分化和矿化的效果;2.比较HPSE刺激健康人和骨质疏松患者来源的成骨细胞增殖、分化和矿化的差异;3.观察HPSE在小鼠骨折模型中促进骨折愈合中的效果,并探讨HPSE促进骨折愈合的机制。 方法 1.从人的血小板中提取HPSE(澳大利亚国立大学TORU实验室提取、纯化)。分别从7例健康成人和7例骨质疏松患者采集骨组织,分离成骨细胞并进行体外原代培养。HPSE原液(400μg/mL)最初由培养基(a-MEM)制备并用0.22μmm的过滤器的消毒。将细胞以4000个/cm2的密度接种到25cm2的培养瓶,96孔板,和6孔板上,经过48小时的培养,用不同浓度的HPSE治疗细胞,包括6μg/mL,3μg/mL,1μg/mL,0.1μg/mL,0.01μg/mL,and0μg/mL的对照组。加入HPSE后,细胞再培养3,5或14天,取决于不同的实验。在培养的第7天,更换细胞培养液并加入新鲜的HPSE。另外,骨形成蛋白-1(osteogenic protein-1, OP-1,0.2μg/mL)用来替换HPSE作为阳性对照。将细胞接种到96孔板进行ATPLite检测,接种到6孔板进行骨矿化检测,接种到25cm2的培养瓶中进行碱性磷酸酶活性检测和流式细胞仪检测。 2.选用36只8-10周龄的Balb/C小鼠,随机选取18只为HPSE治疗组;另外的18只小鼠为对照组。所有小鼠以右后肢股骨为研究对象,建立小鼠股骨骨折模型。治疗组中将10ug/mL的HPSE注射到骨折部位,对照组中将相同剂量的生理盐水注射到骨折部位。术后1周、2周和4周,获取治疗组及对照组标本,将骨折的股骨进行前后位和侧位的X线检查,分别通过正侧位X线片测量骨折部位骨痂的大小;将获取的标本送到悉尼大学进行Micro-CT扫描并三维重建,测量组织总量、骨组织量等参数;取股骨标本的股骨髁部位的松质骨进行骨小梁的重建和测量,观察骨小梁数目、骨小梁厚度、骨小梁空隙以及骨小梁形态因子,评估HPSE在骨折愈合过程中的作用。将获取的骨组织制成5μm的组织切片并行HE染色,光学显微镜下定性观察骨折部位骨痂形成的情况;术后1周,收集治疗组和对照组股骨骨折标本时,留取部分骨组织,进行体外成骨细胞培养,将HPSE加入培养体系后,通过RT2-qPCR序列分析,观察HPSE对小鼠成骨细胞中84个骨生成相关基因的调节作用。 结果 1.通过光学显微镜观察后,用或不用HPSE治疗的细胞均表现相同的成骨细胞表型,说明加入HPSE后,细胞形态未发生改变。与非治疗的对照组相比,HPSE治疗的成骨细胞的数量明显增加,而不是细胞大小增加。与健康人标本来源的成骨细胞相比,骨质疏松标本来源的成骨细胞对HPSE治疗的更敏感,骨质疏松来源的成骨细胞数量的增加更明显。ATPLite检测结果显示,经过HPSE治疗后,健康成骨细胞中ATP的增加多于骨质疏松成骨细胞,在培养的第5天,HPSE治疗的两种成骨细胞中ATP明显增加并存在剂量依赖性。碱性磷酸酶检测结果显示,骨质疏松成骨细胞中ALP的活性水平高于健康成骨细胞,在培养的第5天,HPSE能显著增加所有标本中的ALP活性并具有剂量依赖性。通过计算茜红素-S(AR-S)结合的矿化结节来分析细胞中Ca的水平,在所有标本中,HPSE能显著地增加成骨细胞Ca矿物质的形成,但是在相同的HPSE治疗剂量下,骨质疏松标本中Ca含量的增加水平高于健康标本。ELISA法和流式细胞术分析结果显示,HPSE对人成骨细胞的刺激作用和组蛋白的修饰有关,位于S28的组蛋白H3的磷酸化起主要作用,而不是位于S10的组蛋白H3的磷酸化或乙酰化。 2.在HPSE对小鼠骨折模型中骨折愈合的实验中,术后1周观察两组标本X线检查显示骨折周围可见骨痂形成,骨折线较为明显;术后2周观察两组标本骨折线均模糊不清,可见大量骨痂形成。术后4周,骨折线消失,通过X线判定骨折已愈合。前后位X线片测量显示术后1周HPSE治疗组标本的骨痂的最大横径与对照组标本骨痂的最大横径相比,显著增加(3.26±0.13mm VS2.51±0.12mmm,P=0.0321);术后2周和4周前后位X线片测量结果,以及术后1周、2周和4周侧位X线片测量结果比较无显著的统计学意义。术后1周,组织切片HE染色显示骨折周围骨痂中软骨细胞较多,HPSE治疗组标本中骨痂内形成的微血管较多。术后2周,骨痂完全被骨折周围的新骨和骨折中心的软骨细胞占据。术后4周,在骨折部位新骨形成,形成明显的骨桥连接,骨髓腔再通,骨痂部分被吸收。Micro-CT结果显示术后1周的标本中,治疗组的骨组织的含量(BV/TV)平均为9.24±0.9%,而对照组BV/TV平均为4.64±0.7%,两组之间比较具有显著的统计学意义。根据三维重建获得结果分析,术后1周,骨小梁的数目(Tb.N)在治疗组和对照组标本平均为0.28±0.081/mm和0.1326±0.021/mm;骨小梁之间的间隙(Tb.SP)在治疗组和对照组标本中的平均值分别为1.67±0.12mm和2.36±0.14mm;而骨小梁形态因子(Tb.Pf)在治疗组和对照组标本中的平均值分别为-2.90±0.811/mm和4.97±1.641/mm;Tb.N、Tb.SP和Tb.Pf两组之间比较具有显著的统计学意义。术后2周的标本中,治疗组的BV/TV平均为9.24±0.4%,而对照组BV/TV平均为7.36±0.2%;两组之间比较具有显著的统计学意义。根据三维重建获得结果分析,术后2周,Tb.N在治疗组和对照组标本中平均为0.32±0.021/mm和0.28±0.031/mm,两组之间比较具有显著的统计学意义。Tb.SP、Tb.Pf及Tb.Th两组之间比较无显著的统计学意义。术后4周的标本中,Micro-CT对治疗组和对照组标本测量的所有指标,如BV、BV/TV、TV、 Tb.N、Tb.SP、Tb.Pf及Tb.Th等数据在两组之间比较无显著的统计学意义。在HPSE治疗的标本中,BMP2,ALPL,CSF2,FGFR2和SMAD2均上调,表明HPSE刺激的普遍参与。经HPSE刺激后,BMP6等17个基因表达上调,而RUNX2等8个基因表达下调。 结论 1.通过本研究结果显示,HPSE能够促进健康及骨质疏松来源的体外培养的人成骨细胞增殖、分化和矿化。 2.在小鼠股骨骨折模型中,实验结果初步证实HPSE能在早期促进骨折愈合。 3. HPSE调节骨生长和塑形可能与TGFβ1/SMAD信号通路有关。 实验结果支持HPSE的一种新的治疗作用,就是可作为一种合成代谢的因子参与阻止骨质疏松和促进骨折愈合过程。


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