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抗体靶向多功能金纳米粒子的设计、合成与生物活性研究

焦培福  
【摘要】:第一章前言 近年来,纳米技术迅猛发展,在生物医学领域的应用不断取得突破性进展。许多纳米平台如脂质体、聚合物、结合蛋白、金纳米粒子、超顺磁性铁氧化物以及量子点等已经被开发,并应用于肿瘤的诊断与治疗。其中,金纳米粒子由于具有较好的生物兼容性、尺寸形状依赖的光学与电学特性以及易于修饰的化学表面等独特的物理化学性质,而表现出了能够向临床转化的能力。该部分内容综述了金纳米粒子的制备、修饰以及其在生物医学领域应用的最新进展。 第二章具有抗体靶向性与细胞周期调控功能的金纳米粒子增强X-射线对成神经细胞瘤细胞的毒性 在儿童时期,成神经细胞瘤是最普遍的颅外实体瘤。50%以上的病例出现在小于两岁的儿童群体中。现有治疗手段主要为手术、化疗、放射治疗及干细胞移植。但是,这些治疗手段对于儿童存在明显的副作用,例如导致生长延迟、听力丧失及后天学习障碍等。尽管能够进行综合治疗,该类肿瘤的复发仍然会夺走许多晚期病人(第四期)的生命。根据美国田纳西州St Jude Children's Research Hospital的临床统计,该类病人的五年存活率仅为55%。因而,对于儿童而言,亟待开发更加高效且肿瘤特异性的治疗手段。 GD2神经节苷脂为一类在神经外胚层起源的肿瘤(如成神经细胞瘤、黑色素瘤)表而表达的抗原;在正常组织中,GD2的表达仅局限于神经元、皮肤黑色素细胞及外周疼痛纤维;这些性质使得GD2成为一个理想的抗体治疗靶点。许多抗GD2抗体已经被开发并应用于临床,例如3F8、14G2a、ch14.18、hu14.18以及hu14.18K322A等。其中,hu14.18K322A为Merck KGaA公司开发的一个人源化的抗GD2抗体,在St Jude Children's Research Hospital,该抗体正处于免疫治疗的一期临床阶段。与hu14.18相比,hu14.18K322A在K322氨基酸进行了突变,因而,hu14.18K322A表现出较小的补体激活效应,进而减少了免疫治疗过程中的副作用(如疼痛、发烧等症状)。本文仅仅利用hu14.18K322A作为金纳米粒子识别成神经细胞瘤细胞的靶向分子,并不述及该抗体的发现过程、化学结构以及临床实验的结果。 许多研究已经表明,金纳米粒子能够增强射线对肿瘤细胞的毒性,其作用机理为肿瘤细胞内的金纳米粒子能够增强肿瘤细胞的DNA损伤。但是,到目前为止,并未见到关于不同时期(如G1、S、G2/M)的细胞与金纳米粒子之间相互作用的报道。在这一领域有大量的工作需要化学家及生物学家去完成。另外有研究表明,在细胞周期的不同阶段,细胞对射线(X-射线与伽马射线)的敏感程度并不相同。例如处于S阶段的细胞对射线有较强的耐受性,而处于G2/M阶段的细胞对射线则非常敏感。因此,设计并合成具有细胞周期调控功能的金纳米粒子对于研究不同时期(如G1、S、G2/M)的细胞与金纳米粒子之间的相互作用以及开发新型且高效的成神经细胞瘤细胞特异性的X-射线增敏剂均具有重大意义。 基于以上的理解,本文设计、合成了一种具有抗体靶向性与细胞周期调控功能的金纳米粒子-HPGNP,并对其生物、化学行为进行了详细的研究。 研究目的:合成具有抗体靶向性与细胞周期调控功能的金纳米粒子-HPGNP; 研究意义:(1)为研究不同时期(如G1、S、G2/M)的细胞与金纳米粒子之间相互作用提供物质基础;(2)开发新型且高效的成神经细胞瘤细胞特异性的X-射线增敏剂,降低放射治疗的副作用、提高其治疗效果。 研究结果表明:(1)HPGNP可以特异性地识别成神经细胞瘤细胞,这种特异性是通过hu14.18K322A-GD2的相互作用而实现的;HPGNP并不能识别GD2阴性的PC-3细胞;(2)HPGNP能够被成神经细胞瘤细胞摄取,并将该类肿瘤细胞阻滞于G2/M阶段(HPGNP并不能识别GD2阴性的PC-3细胞,亦不能将其阻滞于G2/M阶段;在成神经细胞瘤细胞内,HPGNP主要存在于内吞体、溶酶体及细胞质内,这对于研究抗原介导的金纳米粒子的内吞过程具有重要的参考价值);(3)与HGNP或PTX相比,HPGNP有效地增强了X-射线对成神经细胞瘤细胞的毒性,同时降低了X-射线对GD2阴性细胞的毒性。细胞在X-射线条件下的存活率:IMR-32(成神经细胞瘤细胞,GD2阳性):82%(HGNP),77%(PTX),19%(HPGNP); CHLA-20(成神经细胞瘤细胞,GD2阳性):80%(HGNP),83%(PTX),18%(HPGNP);而对于GD2阴性的PC-3而言:99%(HGNP),63%(PTX),97%(HPGNP)。这些研究结果表明:一方面HPGNP能够识别成神经细胞瘤细胞并被其所摄取;在细胞内,被摄取的HPGNP能够释放出紫杉醇分子,并将成神经细胞瘤细胞阻滞于G2/M期,进而增强X-射线对成神经细胞瘤细胞的毒性;另一方而,HPGNP并不能识别GD2阴性的PC-3细胞,同时也不能进入GD2阴性的PC-3细胞内,因而,HPGNP能够降低X-射线对GD2阴性细胞(正常细胞)的毒性。这些研究结果对于开发新型且高效的肿瘤治疗手段、增强药物治疗与放射治疗的效果以及降低药物治疗与放射治疗的副作用有重要的参考价值。本文的研究亦表现出纳米医学在肿瘤治疗应用中的实力与灵活性。 第三章Hu14.18K322A靶向的金纳米粒子作为GD2阳性肿瘤细胞分子CT成像的对比试剂 目前,常规的CT对比试剂为含碘的化合物,但这类化合物在实际应用中存在一定的局限性,例如成像时间较短(5-10min)、引起肾脏毒性和特异质反应(如荨麻诊、血管性水肿、喉头水肿、支气管痉挛、严重血压下降及突然死亡等)以及伴随物理化学方面的反应(如恶心、呕吐、潮红、发热及局部疼痛等),更为明显的缺陷是现存的碘类化合物的对比试剂对肿瘤细胞并不具有特异性,同时亦不是分子CT的对比试剂。 金纳米粒子不仅能很好地吸收X-射线(100keV:gold,5.16cm2g-1;iodine,1.94cm2g-1),而且其X-射线弱化能力(衰减)大大高于基于含碘化合物的对比试剂。因此,金纳米粒子作为能够CT成像的对比试剂;而抗体靶向的金纳米粒子将有可能被开发为分子CT成像的对比试剂。 基于以上的理解,本文合成了hu14.18K322A靶向的金纳米粒子-HGNP,并在体外研究了其作为分子CT成像对比试剂的效果。 研究目的:设计、合成能够作为分子CT成像对比试剂的金纳米粒子-HGNP; 研究意义:(1)开发新型的GD2特异性的分子CT对比试剂,以提高CT成像在成神经细胞瘤及黑色素瘤诊断中的灵敏度;(2)Hu14.18K322A在St JudeChildren's Research Hospital正处于一期临床阶段,本文为hu14.18K322A的临床研究提了供标记的手段(金纳米粒子作为标记的材料)。 研究结果表明,HGNP特异性识别GD2阳性的成神经细胞瘤细胞与黑色素瘤细胞,并被这些细胞所摄取。对于GD2阳性细胞或GD2阴性细胞,HGNP均未表现出细胞毒性,这表明该纳米粒子具有较好的生物兼容性,可以用于鼠模型体内分子CT成像的研究。当有NK细胞存在时,该纳米粒子能够杀死成神经细胞瘤细胞。这表明HGNP保留了hu14.18K322A所具有的抗体依赖细胞毒性(ADCC)的性质,即HGNP在体内将有可能寻找并杀死GD2阳性的肿瘤细胞。在合成方面,这一结果亦间接地证明了hu14.18K322A与GNPs的结合方式是随机结合而不是定向结合。在CT条件下,HGNP能够增强GD2阳性肿瘤细胞与周围环境的对比性。这使得CT能够检测出成神经细胞瘤细胞与黑色素瘤细胞的分子标记物-GD2神经节苷脂,即HGNP将有望被开发为成神经细胞瘤与黑色素瘤的分子CT成像的对比试剂,并使得CT成为一种分子成像的手段。这种新型分子成像手段的建立不仅有助于研究肿瘤相关的生物标记分子的表达及活性、对肿瘤相关的分子过程进行示踪,也将为许多微型肿瘤(其大小为毫米级,如早期肿瘤、术后瘤及转移瘤等)的早期诊断提供有力的手段。本文获得的初步体外实验数据将为今后体内研究提供重要的参考。


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