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子宫内膜癌组织中DACH1基因启动子的甲基化状态及其临床意义

邓新超  
【摘要】:研究背景: 子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)是女性生殖器官中常见的三大恶性肿瘤之一,其约占女性生殖道恶性肿瘤的20%-30%,近年来子宫内膜癌在世界范围内其发病率和病死率呈上升趋势,2008年全球新发子宫内膜癌1880000,410000女性死于子宫内膜癌,甚至在部分发达国家,子宫内膜癌成为妇科恶性肿瘤的首位,严重危害女性健康[1]。美国每年有约4万例新发子宫内膜癌病例,2011年新发子宫内膜癌更增至46470例,有8120例死于子宫内膜癌[2]。我国子宫内膜癌发病率也呈逐年升高趋势,己接近甚至超过宫颈癌的发病率。根据其与雌激素的关系分为Ⅰ型(雌激素依赖型)和Ⅱ型(非雌激素依赖型)。Ⅰ型子宫内膜癌癌细胞分化好,雌、孕激素受体表达阳性,预后较好;Ⅱ型子宫内膜癌,恶性程度高,预后差,雌、孕激素受体不表达或弱表达。尽管同卵巢癌、宫颈癌相比,子宫内膜癌的预后较其他生殖器官恶性肿瘤要好,但是子宫内膜癌的5年生存率并不令人满意,子宫内膜癌的5年生存率在Ⅰ~Ⅱ期为83%,在Ⅲ期5年生存率73%,Ⅳ期5年生存率约为62%[3]。 近年来,随着对肿瘤发生发展的分子生物学研究的不断深入,人们逐渐认识到表观遗传学在肿瘤发生发展中的重要作用。表观遗传学修饰主要表现形式有:DNA甲基化(DNA methyaltion)、组蛋白修饰(histone modification)、染色体重塑(chromatin remodeling)和小RNA(microRNA)调控等。这些表观修饰在不改变DNA碱基序列的前提下调控基因的表达而在细胞中形成独特的表型,影响细胞基因的表达,并将此影响随细胞分裂而遗传下去。因此表观修饰是一类高于基因水平的基因调控机制,是将基因型与表型联系起来的纽带[4]。其中DNA甲基化是基因主要的表观遗传修饰形式,目前通过对抑癌基因启动子区CpG岛的过度甲基化研究,认为抑癌基因启动子区CpG岛的过度甲基化是抑癌基因失活的一个重要机制[5]。 DACH1(Cell fate determination factor Dachshund DACH1)是Hammond在哺乳动物中发现的与果蝇dac基因同源的基因,dac基因是果蝇视网膜决定(retinal determination, RD)信号通路(包括ey/Pax6、So/Six、eya/Eya等)的主要成员,dac基因能单独诱导果蝇异位眼的形成,且对细胞分化方向起决定作用[6]。研究发现,DACH1蛋白在乳腺癌[7]、前列腺癌[8]、子宫内膜癌[9]中表达缺失或低表达,提示DACH1基因可能是一种新的抑癌基因。 本研究通过检测DACH1基因启动子在子宫内膜癌细胞系、子宫内膜癌、正常子宫内膜组织中的甲基化状态,比较DACH1蛋白在子宫内膜癌细胞系及子宫内膜癌、正常子宫内膜组织中的表达的差异,分析DACH1蛋白的表达与DACH1基因启动子甲基化之间表达的相关性。并探讨DACH1基因启动子甲基化与子宫内膜癌临床、病理特征间的关系,分析DACH1基因启动子的甲基化在子宫内膜癌发生发展中的作用,从而为子宫内膜癌的诊断、治疗及预后判断提供新的依据。 第一部分不同子宫内膜癌细胞系中DACH1基因启动子甲基化的状态及其与DACH1蛋白表达的关系 目的: 检测不同子宫内膜癌细胞系Ishikawa, ECC-1, SPEC-2, HEC-1-A, KLE中DACH1基因启动子甲基化的差异。探讨DACH1基因启动子甲基化与不同类型子宫内膜癌发生、发展的关系。 材料与方法: 1.子宫内膜癌细胞系Ishikawa, SPEC-2为本实验室所存,子宫内膜癌细胞系KLE, ECC-1, HEC-1-A由王晨光教授惠赠。 采用甲基化特异性PCR (MSP)法检测子宫内膜癌细胞系Ishikawa, ECC-1, SPEC-2, HEC-1-A, KLE中DACH1基因启动子甲基化状态。 2.采用Westernblot法检测子宫内膜癌细胞系Ishikawa, ECC-1, SPEC-2, HEC-1-A, KLE中DACH1蛋白的表达,DACH1蛋白表达阳性的Hela细胞作为该实验的阳性对照。分析DACH1蛋白的表达与DACHI基因启动子甲基化之间表达的相关性。 结果: 一、子宫内膜癌细胞系中高分化子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa, ECC-1未检测到DACHI基因启动子甲基化产物,中分化子宫内膜腺癌细胞系HEC-1-A、低分化子宫内膜腺癌细胞系KLE中DACH1基因启动子甲基化阳性,浆液性腺癌子宫内膜癌细胞系SPEC-2中DACHI基因启动子甲基化阳性。 二、DACHI蛋白在子宫内膜癌细胞系Ishikawa, ECC-1, SPEC-2, HEC-1-A, KLE中均有表达,但在低分化子宫内膜癌KLE、浆液性腺癌内膜癌细胞系SPEC-2中表达较弱。 结论: 1.不同子宫内膜癌细胞系中DACH1基因启动子甲基化存在差异,DACH1基因启动子的甲基化状态在人类子宫内膜癌特别是低分化子宫内膜癌及Ⅱ型子宫内膜癌发生、发展的分子机制中起着重要的作用。 2. DACH1蛋白在子宫内膜癌细胞系SPEC-2、KLE中的低表达与DACHI基因启动子区CpG岛的甲基化状态有关。 第二部分子宫内膜癌DACH1基因启动子甲基化及其与患者临床病理特征的关系 目的:探讨子宫内膜癌组织中DACHl基因启动子区甲基化状态及其与子宫内膜癌临床病理特征之间的关系。 方法: 1.选取山东大学齐鲁医院及山东大学第二医院2004年2月-2008年8月经病理检查证实的子宫内膜癌患者80例,行全面分期手术,取其新鲜癌组织,部分组织用10%甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,其中1张行HE染色复诊,部分组织放-70℃冰箱冷冻备用。患者年龄31-72岁,平均54.6岁;按照国际妇产科联盟(FIGO,2000)提出的内膜样癌组织3级分类法,该80例子宫内膜癌组织标本中病理学分级为G1级的有21例,占26.25%,病理学分级为G2级的有18例,占22.50%,病理学分级为G3级有41例,占51.25%。手术病理分期:Ⅰ期患者51例,占63.75%,Ⅱ期患者15例,占18.75%,Ⅲ期患者11例,占13.75%,Ⅳ期患者3例,占3.75%。按病理类型分类,子宫内膜样腺癌共53例,占66.25%,浆液性乳头状腺癌共16例,占20%,透明细胞癌共11例,占13.75%。80例标本中子宫肌层浸润≤1/2者61例,占76.25%,子宫肌层浸润1/2的患者共19例,占23.75%。淋巴结转移者14例,占17.5%,无淋巴结转移66例,占82.5%。 采用甲基化特异性PCR (MSP)法检测子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织中DACH1基因启动子的甲基化状态,并分析DACH1基因启动子甲基化与子宫内膜癌手术病理分期、组织病理学分级、肌层浸润程度、淋巴结转移、病理学类型、年龄等临床病理学参数的关系,探讨DACH1基因启动子甲基化与子宫内膜癌发生发展的关系。DACH1基因启动子甲基化在不同组织中阳性率的比较,及其表达与各临床病理指标之间关系的比较采用x2检验和校正x2检验。 2.选取同期(2008年)因功能失调性子宫出血行诊断性刮宫患者病理证实为正常子宫内膜组织20例作为对照。采用Western法检测80例子宫内膜癌子宫内膜组织和正常子宫内膜组织20例中DACH1蛋白的表达,DACH1蛋白表达阳性的Hela细胞作为该实验的阳性对照。比较DACH1蛋白在各种组织中的表达的差异,分析DACH1蛋白的表达与DACH1基因启动子甲基化之间表达的相关性。 结果: 一、80份子宫内膜癌组织中,24份组织DACH1基因启动子甲基化阳性,其甲基化率为30%(24/80);20份正常子宫内膜组织中,仅1份组织DACH1基因启动子甲基化阳性,其甲基化率为5%(1/20),两者甲基化率比较,差异有统计学意义(P0.05)。 二、子宫内膜癌组织中,DACH1基因启动子的甲基化状态与病理分级、病理类型有关,G1-G2癌组织中DACH1基因启动子的甲基化率为18%(7/39),显著低于G3者(41%,17/41),差异有统计学意义(P0.05);子宫内膜样腺癌组织中DACH1基因启动子的甲基化率为23%(12/53),显著低于特殊类型子宫内膜癌(44%,12/27),差异有统计学意义(P0.05)。而DACH1基因启动子的甲基化状态与患者年龄、手术病理分期、肌层浸润深度及淋巴结转移无关(P0.05)。 三、在DACH1基因启动子呈甲基化状态的子宫内膜癌组织中DACH1蛋白呈现不表达或者低表达状态,而在DACH1基因启动子呈未甲基化状态的子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中DACH1蛋白呈现高表达状态。24例子宫内膜癌组织样本DACH1的表达水平与DACH1启动子区甲基化程度进行相关性分析,发现二者之间存在负相关(r=-0.30,P0.05) 结论: 1.低级别的子宫内膜癌中DACH1基因启动子的甲基化率高,提示DACH1基因启动子的甲基化可能与患者的不良预后有关。 2. DACH1基因启动子的高甲基化状态在人类子宫内膜癌特别是特殊类型子宫内膜癌发生、发展的分子机制中起着重要的作用。 3. DACH1基因在子宫内膜癌组织中的低表达或者表达缺失与DACH1基因启动子区CpG岛的甲基化状态有关。同时证明DACH1基因具有抑癌基因的特点。


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