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53BP1在上皮性卵巢癌发生发展中的作用及其机制的研究

洪淑惠  
【摘要】:卵巢癌,尤其是上皮性卵巢癌,是威胁全世界女性健康的恶性肿瘤之一。WTO统计资料显示:在全世界女性生殖道恶性肿瘤中,卵巢癌的发病率和死亡率均仅次于宫颈癌而位居第二位,因此有必要研究其发生发展规律及机制,为寻求有效的治疗方法,改善患者预后奠定基础。近年来,随着分子生物学及遗传学的发展,研究者发现卵巢癌也是一种基因型疾病,其形成和病情演进与基因突变有关,包括抑癌基因的失活或者癌基因的激活。53BP1是内源性双链DNA损伤的标志分子之一,主要参与DNA损伤修复反应,触发受损细胞的周期阻滞以稳定细胞的遗传信息,从而防止肿瘤的形成和进展。本课题主要探讨53BP1在上皮性卵巢癌的发生发展中的作用及其机制,目前国内外鲜有这方面的报道。课题的研究内容主要包括以下部分: 一、53BP1对卵巢癌细胞增殖能力影响的研究; 二、53BP1对卵巢癌细胞侵袭能力及顺铂耐药性影响的研究; 三、53BP1对卵巢癌细胞裸小鼠致瘤能力影响的研究。背景和目的:目前,研究者对53BP1在DNA损伤修复反应体系中的重要作用已经做了大量的研究。但是53BP1究竟在上皮性卵巢癌的发生发展过程中扮演什么角色,迄今为止鲜有报道。此项研究的目的就是调节上皮性卵巢癌细胞中53BP1基因的表达水平,观察53BP1蛋白改变对上皮性卵巢癌细胞增殖能力的影响,并探求由53BP1触发的相应机制。材料和方法:选取上皮性卵巢癌SKOV3细胞作为研究对象,通过DNA脂质体将53BP1的表达质粒和干扰质粒分别转染至SKOV3细胞,使SKOV3细胞中的53BP1蛋白过表达或者降调解。分别通过MTT实验,克隆形成能力实验及流式细胞仪检测分析SKOV3细胞的生长曲线、克隆形成率、细胞周期及凋亡率,分析53BP1蛋白改变后,SKOV3细胞的增殖能力的变化。Western blot检测Bcl-2,p-Akt, Bax及P21wafl/cipl等细胞因子的表达情况。结果:当SKOV3细胞中53BP1蛋白过表达时,其生长速度变慢,克隆形成能力减弱(过表达组SKOV3/pLPC-53BP1细胞:134±9克隆/500细胞,对照组SKOV3/pLPC-vector细胞:152±22克隆/500细胞),另外细胞表现出G2/M期阻滞(过表达组:26.68±2.11%,对照组13.02±1.30%),细胞凋亡率增加(过表达组:23.48±3.20%,对照组:9.34±2.12%)(P0.05)。细胞中诱导凋亡及细胞周期阻滞的蛋白,Bax及P21wafl/cipl表达增强。凋亡抑制因子及促增殖蛋白,Bcl-2及p-Akt,表达减弱。当降调SKOV3细胞中的53BP1蛋白时,其结果与过表达实验相一致。结论:53BP1通过抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖能力阻滞其发生发展。 背景和目的:卵巢癌预后差,一是因为癌细胞在盆腔及腹腔的广泛播散致使手术治疗不彻底;二是缘于癌细胞对药物产生原发性或继发性耐药性,导致肿瘤的复发或转移。本部分研究的目的是探讨53BP1与卵巢癌细胞侵袭能力及顺铂耐药性之间的关系及其相关机制。材料和方法:通过稳定转染的方法,改变上皮性卵巢癌细胞SKOV3中53BP1的表达水平。通过transwell侵袭实验计数穿膜贴壁细胞的数目,检测过表达组SKOV3/pLPC-53BP1细胞,干扰组SKOV3/pSUPER-53BP1细胞及其相应对照组SKOV3/pLPC-vector细胞,SKOV3/pSUPER-vector细胞侵袭能力的改变。明胶酶谱法检测细胞中基质金属蛋白酶MMP-2及MMP-9的表达情况。MTT及western blot方法分别检测不同浓度的顺铂作用72小时后,53BP1对各组细胞化疗敏感性的影响及相关蛋白的表达水平改变。结果:与对照组SKOV3/pLPC-vector细胞(230±58细胞)相比较,过表达组SKOV3/pLPC-53BP1细胞的侵袭能力明显减弱(45±12细胞)(P0.05),MMP-9分泌水平明显下降,而两组间MMP-2分泌量无明显差异(P0.05)。但是53BP1增加了卵巢癌细胞对于顺铂的耐药性(过表达组SKOV3/pLPC-53BP1细胞的IC50为7.58±0.51μg/ml,而对照组SKOV3/pLPC-vector细胞的IC50为2.98±0.27μg/ml。P0.01)。随着顺铂作用浓度的逐渐增加,SKOV3/pLPC-53BP1细胞中P21wafl/cipl及Bax蛋白表达量呈下降趋势,而p-Akt、Bcl-2蛋白表达量呈上升趋势。当SKOV3细胞中的53BP1蛋白表达降低时,侵袭和顺铂耐药性实验结果与过表达实验相一致。结论:53BP1通过降调节MMP-9的分泌水平抑制SKOV3细胞的侵袭能力;但是53BP1却增加了顺铂作用下卵巢癌细胞的凋亡抑制因子的蛋白水平,增加了SKOV3细胞的顺铂化疗耐药性。 背景和目的:借助肿瘤动物模型,人们能够更深刻的认识人类肿瘤的发生发展规律,评价肿瘤治疗方法的优劣。动物移植瘤模型的形成与否很大程度上依赖于肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,研究发现肿瘤抑制基因可以降低或逆转肿瘤细胞的成瘤率。我们在前两部分的研究证实细胞中53BP1蛋白水平改变可以影响卵巢癌细胞SKOV3的生物学行为,削减其增殖和侵袭能力,本部分研究的目的是探讨53BP1对于裸小鼠卵巢癌皮下移植瘤形成的影响。材料和方法:将前期稳筛成功的卵巢癌细胞(过表达组SKOV3/pLPC-53BP1细胞及干扰组SKOV3/pSUPER-53BP1,其对照组分别为SKOV3/pLPC-vector细胞和SKOV3/pSUPER-vector细胞)接种于裸小鼠皮下(每组8只裸小鼠),观察并比较各组动物的肿瘤形成时间,裸小鼠生物学行为的改变,测量移植瘤的大小及生长速度,应用Kaplan-Meier及log-rank方法分析各组荷卵巢癌裸小鼠生存时间的差异,探讨53BP1对于裸小鼠皮下移植瘤致瘤能力的影响。结果:四种卵巢癌细胞的裸小鼠皮下移植瘤成功率均为100%。裸小鼠皮下成瘤时间过表达组SKOV3/pLPC-53BP1细胞最长为28.50±2.07天,移植瘤大小为0.53±0.12cm(接种60天时),其对照组SKOV3/pLPC-vector细胞成瘤时间为22.88±2.90天,移植瘤大小1.12±0.23cm(接种60天时)(P0.05);干扰组SKOV3/pSUPER-53BP1细胞成瘤时间最短为14.88±1.46天,移植瘤大小2.52±0.72cm(接种60天时),其对照组SKOV3/pSUPER-vector细胞成瘤时间为20.75±5.34天,移植瘤大小0.94±0.11cm(接种60天时)(P0.05)。Kaplan-Meier及log-rank结果显示SKOV3/pLPC-53BP1组荷瘤裸小鼠生存时间较SKOV3/pLPC-vector组明显延长(分别为110±5.15天及100±2.97天,P0.01),SKOV3/pSUPER-53BP1组荷瘤裸小鼠生存时间明显较SKOV3/pSUPER-vector组缩短(分别为87±5.22天及96±7.92天,P0.05)。结论:53BP1能够抑制裸小鼠卵巢癌细胞皮下移植瘤的形成,延长荷瘤裸小鼠的生存时间。


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