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用线虫模型研究白念珠菌生物膜中滞留菌对抗真菌治疗效果的影响

贾奋  
【摘要】:目的 生物膜是微生物在自然状态下的生存方式,其最重要的特征是生物膜微生物具有很强的耐药性。作为人类最常见的条件致病真菌,白念珠菌(Candida albicans)在粘膜组织和植入性医疗器械表面形成生物膜,对多种抗真菌药物高度耐受。Lewis等研究指出,白念珠菌生物膜中存在一小部分表现型耐药菌株,在一定范围内提高药物浓度或延长药物作用时间也不能将其杀灭,这部分菌株被称为滞留菌(persisters)。由于这种耐药性不具有遗传性,因此滞留菌并不是传统意义上的耐药菌株。Lewis认为滞留菌的存在可能是生物膜具有耐药性的真正原因,并且与临床上常见的慢性反复性感染有密切关系。研究滞留菌在慢性顽固性感染中的作用和对抗菌治疗效果的影响,具有重要的临床意义。 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是常见的模式生物,用其建立白念珠菌感染模型可进行抗真菌治疗的研究。白念珠菌感染线虫后,产生菌丝,形成生物膜,可导致线虫的死亡。在前期研究工作中,本课题组从52名接受化疗的恶性肿瘤病人口腔中获得了131株白念珠菌临床株,用100ug/ml的两性霉素B冲击其在96孔板中生长24小时形成的生物膜,筛选出了产生滞留菌比例为0.2%~9%的临床株。这些临床株均为非耐药株,对两性霉素B的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)差别不大。本实验用秀丽隐杆线虫感染产生不同滞留菌比例的白念珠菌临床株并用两性霉素B处理,观察比较线虫的存活率来探讨滞留菌的耐药性对抗真菌治疗效果的影响。 材料和方法 菌株和线虫:产生高比例滞留菌的白念珠菌临床株6株(滞留菌产生比例在8-9%);产生低比例滞留菌白念珠菌临床株6株(滞留菌产生比例均低于0.3%);白念珠菌标准株3153a(滞留菌产生比例约为1%)。线虫采用AU37glp-4(bn2)I; sek-1(km4)突变株。 抗真菌药物:两性霉素B 线虫的同步化培养:线虫于15℃培养5-6天至怀孕后,用M9缓冲液冲下,加入裂解液,震荡裂解收集线虫卵,在M9缓冲液中孵化24h,得到L1期幼虫,将幼虫转移到NGM培养基上25℃培养3天,得到同步化的L4期成虫。 白念珠菌线虫感染模型的建立:将同步化的L4期线虫分别转移到含有白念珠菌各菌株菌苔的BHI培养基上,25℃共培养2小时(预留作为空白对照的不染菌线虫)。用M9缓冲液洗脱虫体,离心清洗3遍并制成线虫悬浮液。按照高比例滞留菌组6组,低比例滞留菌组6组,标准株组和不染菌空白组的顺序,96孔板中每孔加入含15~20条线虫的M9悬浮液20μl后,再加入用40%BHI液体培养基+60%M9缓冲液二倍梯度稀释的两性霉素B130μl,使每组药物浓度梯度为0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0μg/ml,并设立不加药孔对照。每种处理均设三孔平行对照。将96孔板于25℃培养5天后观察计算各孔线虫存活率。 结果 各染菌组不加药线虫存活率相差较小,组内加药孔线虫存活率较不加药线虫均有提高。随着药物浓度的增加,线虫死亡率呈U型趋势,药物浓度为2-4μg/ml时各组内加药线虫较不加药线虫的存活率的提升达到最高。相同药物浓度下,高比例组线虫较同组不加药线虫存活率的提高量明显低于感染低比例组的提高量,差异有统计学意义(P0.01)。两性霉素B治疗感染产生高比例滞留菌临床株的线虫效果不明显,产生高比例滞留菌的白念珠菌临床株在体内更难以被抗真菌药物杀灭。 结论 秀丽隐杆线虫-念珠菌滞留菌模型为今后筛选抗滞留菌的药物提供了药效学评价模型;致病菌株产生滞留菌的能力具有重要的临床意义,即滞留菌耐药性可能是抗菌治疗失败和复发性感染的重要原因;对慢性真菌感染来说,检测临床菌株产生滞留菌的能力,可能会成为一种常规检测手段,成为预测慢性感染性疾病的预后和治疗困难程度的一个重要指标。


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