mTOR抑制剂缓解比格犬蛛网膜下腔出血模型脑血管痉挛的实验研究

【摘要】：研究背景： 蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)的高死亡率和高致残率主要与早期脑损伤(Early brain injury, EBI)和接下来出现的脑血管痉挛(Cerebral vasospasm, CVS)有关。尽管现在有许多针对CAS的治疗方法,但成功治疗的情况并不多见,而脑血管痉挛的发生机制仍是困扰大多数研究者的难题之一。 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在调节细胞的生长、增殖、存活和蛋白质合成中起着重要的作用。mTOR是PI3K/PKB (protein kinase B, PKB)信号通路下游的一个效应蛋白,包括2种下游底物蛋白：70S核糖体6激酶S6K1(p70S6kinase protein, S6K1)和4E-BP1(4E-binding protein1,4E-BP1)。 作为一种蛋白激酶,mTOR在细胞内形成了两种主要不同的多蛋白复合物,分别为mTORCl和mTORC2。雷帕霉素(rapamycin, mTOR抑制剂)仅能抑制mTORCl。AZD8055是一种新型的mTOR抑制剂,能抑制：mTORC1和mTORC2,进而抑制mTOR的活性。但mTOR抑制剂在血管痉挛中的作用尚未见报道。 目的： 采用犬两次注血法制作蛛网膜下腔出血(SAH)模型,旨为研究mTOR通路蛋白在SAH后发生CVS时在血管壁,尤其在血管平滑肌细胞上的表达情况,观察它们在调节脑血管痉挛中的作用。应用mTOR复合物1抑制剂(雷帕霉素)和mTOR复合物1/mTOR复合物2(mTOR Cl/mTOR C2)抑制剂(AZD8055),通过对mTOR通路下游蛋白P70S6K1和4E-BP1,以及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)等能够与增殖活动相关因子的表达情况观察,以研究mTOR信号通路中的重要因子,如mTCR、P70S6K1和4E-BP1在蛛网膜下腔出血病程中的作用及可能的引发CVS的机理。 材料与方法： 实验动物为30只比格犬,雌雄不分,体重15～20kg。随机平均分成5组,即假实验组(Sham, n=6),蛛网膜下腔注血组(SAH,n=6),蛛网膜下腔注血组结合应用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)组(SAH+DMSO, n=6),蛛网膜下腔注血组结合应用雷帕酶素(2mg/kg体重,SAH+RAPA, mTORCl抑制剂,n=6)和蛛网膜下腔注血组结合应用AZD8055(2mg/kg体重,一种mTORCl/mTORC2抑制剂)组(SAH+AZD8055, n=6)。动物采用乙酰丙嗪、阿托品和甲苯噻嗪全身麻醉后,在实验当天(d0)和实验后的第2天(48h),穿刺针刺破寰枕膜,放出适量脑脊液,将自体股动脉的血液注射到蛛网膜下腔(小脑延髓池),建立犬的蛛网膜下腔的两次出血模型,在实验的当天(d0)和第实验后的第7天(d7)行血管造影,观测动物的临床行为学改变、基底动脉的直径。取基底动脉行组织学观察、免疫组织化学染色和Western blot,检测基底动脉的形态学变化及其血管壁中mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的表达。 结果： 肉眼观察,蛛网膜下腔内有大量的凝血块分布于脑干的腹侧Willis环的周围,即出现在延髓腹侧的延池、中脑的脚间池和视交叉池,以及基底动脉的周围。血管造影图像中,7天(d7)的基底动脉的平均直径,与假实验组相比,SAH组和SAH+DMSO组均出现了严重的基底动脉痉挛p0.05)。而SAH组和SAH+DMSO组的7天(d7)与0天(d0)的基底动脉的平均直径的百分比分别是34.3±19.84%和38.4±10.26%,而假实验组的基底动脉的平均直径百分比是93.9±5.01%。在SAH+RAPA组和SAH+AZD8055组可见中度的血管痉挛,SAH+RAPA组和SAH+AZD8055组的7天(d7)与0天(d0)基底动脉的平均直径的百分比分别是62.3±15.92%和65.2±10.34%,与SAH组和SAH+DMSO组相比,可见显著性差异(p0.05)。 在临床行为学饮食评分方面：从第2天到第4天,与SAH组相比,SAH+RAPA组和SAH+AZD8055组动物的饮食情况明显好转,在实验后的5天至7天间,仍可见显著的统计学差异(p0.05,ANOVA)。但SAH+RAPA组和SAH+AZD8055组之间未见统计学差异(p0.05,ANOVA)。在活动度评分方面：在实验后的6天至7天,与SAH组和SAH+DMSO组相比,SAH+RAPA组和SAH+AZD8055组动物的活动度明显增强,可见显著的统计学差异(p0.05,ANOVA)o但SAH+RAPA组和SAH+AZD8055组之间未见统计学差异(p0.05,ANOVA)。在神经功能障碍评分方面：大多数的实验动物并没有表现出明显地神经功能障碍的症状和体征,在所观察的各组间的统计学差异不明显(p0.05)。 通过对基底动脉的HE染色后的形态学观察,SAH组可见明显的血管痉挛,即基底动脉发生了明显的收缩,管壁增厚,管腔直径明显缩小,内皮细胞和血管平滑肌由于收缩而变短,内弹力膜弯曲呈锯齿状,部分内皮细胞失去了连续性并从内弹力膜上脱离。SAH+RAPA和SAH+AZD8055组动物的基底动脉可见中等程度的血管痉挛。而假实验组(Sham)动物的基底动脉未见血管痉挛的表现。 与假实验组的动物相比,在SAH组和SAH+DMSO组中,基底动脉各层中,尤其是平滑肌细胞中的mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的免疫组化染色均很明显。用雷帕霉素和AZD8055治疗的两组动物中,mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的染色则都有明显的减弱。双荧光和三荧光免疫组化染色显示,基底动脉的各层中,尤其是在平滑肌层中,均可见mTOR、P70S6K1和PCNA的表达。双色和三色免疫荧光图像提示：mTOR与P70S6K1和PCNA共存。使用高变焦放大摄像,染色证实mTOR、P70S6K1和PCNA共同定位于血管平滑肌细胞中。 Western blotting显示了血管痉挛动脉中(?)mTOR通路分子标志物的表达,与假实验组相比,在蛋白电泳条带上,可见SAH组和SAH+DMSO组动物中,痉挛的基底动脉中的mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的表达均有明显增加。雷帕霉素和AZD8055明显抑制了mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的表达,可见显著地统计学差异(p0.05)。而在两种抑制剂治疗组之间、SAH组和SAH+DMSO组之间,mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的表达未见明显的统计学差异。 结论： 本研究显示：在SAH后,mTOR通路的活化可能通过启动血管平滑肌细胞的增殖,从而参与了基底动脉痉挛的调控；在基底动脉中观察到了mTOR通路的mTOR、P70S6K1和4E-BP1与PCNA等多种因子的表达；应用mTOR抑制剂----雷帕霉素和AZD8055后,mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA等因子的表达出现明显的变化,并可明显解除基底动脉的痉挛,改善动物的饮食和活动度等临床表现。而受(?)mTOR蛋白信号通路调节的血管平滑肌细胞的增殖,在蛛网膜下腔出血的脑血管痉挛中发挥着重要的作用。通过抑制(?)mTOR通路的活性,脑血管痉挛出现缓解,这可能是治疗蛛网膜下腔出血脑血管痉挛的重要途径。