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Cytophaga hutchinsonii纤维素降解及滑动相关基因的研究

季晓飞  
【摘要】:进入21世纪以来,能源危机、环境污染的问题越来越突出,影响到了人类的健康生存和可持续发展。发展可持续的、绿色能源来代替石油、煤炭等化石资源已经成为人们迫切的需求。以木质纤维素为主要成分的植物生物质是地球上最丰富的可再生资源,对木质纤维素的开发利用越来越受到人们的重视。由于纤维素自身结构致密,并存在结晶区,不容易被酶解,使得现有的纤维素生物转化效率低,成本高。因此揭示自然界中高效的纤维素降解机制,提高结晶纤维索的降解效率是木质纤维素利用的关键。 Cytophaga hutchinsonii是一种自然界中广泛分布的纤维素降解细菌,具有极强的结晶纤维素降解能力。C. hutchinsonii不分泌游离的纤维素酶也没有纤维小体结构,表明其具有不同于已知的好氧真菌或厌氧细菌的独特的结晶纤维素降解机制。此外,C. hutchinonii的不依赖于鞭毛或纤毛的滑动机制也是未解之谜。C. hutchinsonii降解纤维素时,菌体有序地排列在纤维素纤维上,研究者猜测Chutchinsonii的滑动与纤维素降解有关。对C. hutchinsonii新型结晶纤维素降解机制的研究能够丰富人们对微生物纤维素降解策略的认识,并有助于对现有纤维素降解酶系的改进和提高,促进纤维素资源的开发利用。之前由于缺少成熟的遗传操作体系,对C. hutchinsonii纤维素降解与滑动的研究进展十分缓慢。近几年我们实验室初步建立C. hutchinsonii的部分遗传操作技术,为纤维素降解及滑动机制的研究深入到分子水平奠定了基础。本文首次建立了Himai转座子的插入突变和基因回补技术,为基因功能的研究创造了条件。利用这些技术首次筛选到多个参与C. hutchinsonii纤维素降解与滑动的关键基因,并分别对其基因功能进行了深入研究。在此基础上发现了C. hutchinsonii存在细胞表面的纤维素利用途径,并对菌体运动与纤维素降解之间的关系进行了探讨。这些研究工作对揭示Chutchinsonii独特的纤维素降解和滑动机制有着重要意义。具体内容和结果如下: 1. Himar转座子插入突变和基因回补技术的建立 转座子插入突变是研究基因功能的有效手段。我们尝试了两种转座子Tn4351和HimarEm3对C. hutchinsonii (?)勺转座插入突变,转座子HimarEm3改造自HimarEM1。发现在接合平板中加入20μg/ml的Km可以将接合转化效率提高一倍,通过优化接合转化条件,两种转座子的转化率分别达到3.0×10和1.2×10-6。对Tn4351在F. Johnsonicae(?)中的转座插入研究发现其插入形式比较复杂多样。我们通过Southern blot分析了HimarEm3在C. hutchinsonii中的插入情况,发现其大多情况下是单插入形式,这表明HimarEm3是很好的插入失活研究基因功能的工具。 红霉素是已知的在C. hutchinsanii中唯一可用的抗生素筛选标记,筛选标记的缺少限制了C. hutchinsonii中的遗传操作。通过实验发现头孢西丁抗性基因(cfxA)和四环素抗性基因(tetQ)能够在C. hutchinsonii中表达。以此为筛选标记构建了可用于回补转座子Tn4351和HimarEm3的插入突变的质粒载体,为转座插入研究基因功能创造了条件。 2. CHU_0134基因功能研究 菌体对纤维素的吸附是其酶解的第一步,序列分析发现C. hutchinsonii(?)编码的纤维素酶大都不含CBM,菌体与纤维素直接接触是纤维素降解所必需的。我们通过转座子HimarEm3的插入突变筛选到一株菌体对纤维素的吸附率只有野生菌株一半的突变株A-4。表型测定发现A-4不能降解纤维素并表现出琼脂表面菌落扩散缺陷。纤维素酶活测定发现突变株细胞表面及胞外的内切纤维素酶酶活下降40%。纤维素吸附外膜蛋白的SDS-PAGE电泳发现,突变株中大部分的纤维素吸附外膜蛋白含量降低或消失。质谱鉴定差异蛋白条带为一些Gld蛋白(CHU0171、0173、0174、3494)和一些未知功能蛋白(CHU_3654、1277、3655)。这些蛋白可能在C. hutchinsonii的纤维素吸附、降解中起重要作用。 Southern blot与反向PCR确定A-4中HimarEm3的插入基因为CHU_0134。回补基因CHU0134(?)使突变株的纤维素吸附、降解及琼脂表面的菌落扩散表型恢复。研究结果表明CHU_0134能够影响C. hutchinsonii(?)菌体的纤维素吸附、降解以及在琼脂表面的菌落扩散。序列分析预测CHU0134编码一个硫醇-二硫化物异构酶,在C-端有包含C-G-H-G的类TlpA结构。硫醇-二硫化物异构酶可以催化蛋白质中二硫键的异构作用,对于很多细胞质以外的蛋白质的结构以及稳定性是非常重要的。序列比对发现拟杆菌中有很多蛋白与CHU0134有较高的序列相似性,而且大都含有保守的C-G-H-C序列,这类蛋白的功能值得研究。 3.CHU1277基因功能研究 CHU1277编码一个纤维素吸附外膜蛋白,我们通过基因的定点插入失活构建了CHU_1277失活突变株(△1277),纤维索吸附外膜蛋白中CHU_1277蛋白条带缺失证明CHU_1277被失活。RT-PCR显示△1277中CHU_1277的临近基因的转录没有受到影响。△1277表现出纤维索利用缺陷以及纤维寡糖利用能力的降低,说明CHU_1277是影响C. hutchinsonii (?)纤维素类底物利用的关键基因。 △1277的内切纤维素酶酶活与野生菌株相比没有明显变化,菌体表面β-葡萄糖苷酶酶活下降30%。HPLC分析菌体对纤维二糖的水解发现A1277菌体的纤维二糖水解能力明显低于野生菌株,与△1277利用纤维二糖的生长很弱相吻合。然而提取的△1277的外膜蛋白却表现出与野生菌株相似的β-葡萄糖苷酶酶活和纤维二糖水解能力。这表明突变株细胞表面的β-葡萄糖苷酶并没有减少,只是活力没有充分展现出来。细胞表面蛋白CHU_1277对位于细胞表面的β-葡萄糖苷酶的酶活充分发挥可能是必需的。 提取的突变株的外膜蛋白有着与野生菌株基本相同的纤维素酶酶活以及纤维素水解能力,表明突变株外膜蛋白中的纤维素酶的量与野生菌株基本相同,纤维素酶并不是导致突变株纤维素降解缺陷的主要原因。这暗示着只有纤维素酶对C. hutchinsonii的纤维素降解还是不够的,某些非酶蛋白的参与是纤维素降解所必需的。CHU_1277是发现的第一个影响C. hutchinsonii纤维素降解的表面蛋白。深入探索CHU_1277如何影响C. hutchinsonii的纤维素降解将对阐明其独特的纤维素降解机制有着重要意义。 4. C. hutchinsonii对纤维二糖的利用 纤维二糖是已知的C. hutchinsonii可以利用的少数几种寡糖之一,又是纤维素降解中的重要中间产物。我们首次研究了C. hutchinsonii(?)寸纤维二糖的利用方式。虽然基因组序列分析预测可能的β-葡萄糖苷酶都位于细胞周质,但是多次酶活实验表明大部分的β-葡萄糖苷酶活力位于细胞表面。菌体对纤维二糖的水解实验也表明C. hutchinsonii的细胞表面有很强的纤维二糖水解能力,目前正在对细胞表面的β-葡萄糖苷酶进行研究。 HPLC分析C. hutchinsonii在纤维二糖培养基中生长时培养基中的糖分变化发现,接种之后,培养基中的纤维二糖就被逐渐水解,葡萄糖逐渐积累,在Chulchinsonii达到对数生长中期之前,培养基中的纤维二糖已经基本被完全水解,积累了很高浓度的葡萄糖,葡萄糖成为支持细胞对数生长中期之后继续生长的唯一碳源。这表明通过细胞表面的β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖再吸收利用是C. hutchinsonii利用纤维二糖的主要途径。 5. C. hutchinsonii细胞表面的纤维素降解 HPLC分析菌体对纤维索的水解产物发现一部分的纤维素可以在Chutchinsonii的细胞表面被降解。通过加入葡萄糖酸内酯抑制β-葡萄糖苷酶酶活以及加入NaN3(?)抑制细胞的呼吸产能,发现细胞表面的纤维素降解是先由内切纤维素酶将纤维素水解为纤维寡糖(纤维二糖、三糖、四糖),然后再由β-葡萄糖苷酶将纤维寡糖水解为葡萄糖。提取的C. hutchinsonii的外膜蛋白中有内切纤维素酶酶活和β-葡萄糖苷酶酶活,能够在体外水解纤维素,葡萄糖是唯一产物,说明纤维素在外膜蛋白中的内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的共同作用下能够被水解为葡萄糖,这也支持纤维素细胞表面降解。 纤维素细胞表面降解不符合Wilson提出C. hutchinsonii的纤维素降解模型,模型中预测纤维素链从纤维素上被剥离下来,然后运到细胞周质中进一步被内切纤维素酶降解。在我们的实验中,在胞外只检测到很少量的纤维寡糖产物,因此尚不能确定纤维素的细胞表面降解是C. hutchinsonii利用纤维素的主要方式。但是在C. hutchinsonii的细胞表面的确存在纤维素降解过程,并且降解产物可以被菌体吸收。而C. hutchinsonii是以何种形式吸收纤维索水解产物的还有待进一步的研究。 6. CHU_1797基因功能研究 我们通过转座子HimarEm3的插入突变以及基因回补确证了一个新的影响C. hutchinsonii在琼脂表面菌落扩散的基因,(CHU_1797。序列分析预测CHU_1797编码一个包含未知功能结构域DUF3308的外膜蛋白。比对发现与CHU_1797有序列相似性的蛋白广泛分布于拟杆菌中,大都含有未知功能结构域DUF3308,预测大都定位在膜上。这类膜蛋白可能与菌体的运动有关,有待进一步研究。CHU1797失活突变株在琼脂表面的菌落扩散出现缺陷,进一步影响了菌体在琼脂农面趋向葡萄糖的运动以及与埋在琼脂中的纤维素底物的接触。但是CHU1797的失活并不影响单个菌体在玻璃表面上的滑动,突变株对纤维索的降解能力也没有明显变化。扫描电镜观察发现,突变株菌体在纤维素纤维上排列有序,与野生菌株的现象相同。这说明C. hutchinsonii在琼脂表面的菌落扩散能力不是菌体在玻璃表面的个体运动以及纤维索降解所必需的。C. hutchinsonii(?)琼脂表面的菌落扩散与在玻璃表面的个体运动是两种不同的运动形式,存在着不同的机制,而单个菌体在玻璃表面的运动可能与菌体在纤维素纤维上的有序排列相关。


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