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新型苯并噁嗪衍生物ABO靶向Annexin A7和抑制动脉硬化的机制研究

李海英  
【摘要】:血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)遍布机体全身,位于血管壁的最内层,内皮细胞功能紊乱是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要诱因之一。适中水平的自噬可以保护血管内皮细胞抵御环境胁迫。因此,血管内皮细胞自噬的调节可能为预防和治疗动脉粥样硬化提供新的方案。 VEC自噬的发生与多种细胞不同。多种细胞在血清饥饿时发生自噬,而VEC在血清饥饿条件下会迅速发生凋亡,而且VEC在体内通常与血液接触,因此,VEC的自噬具有明显的细胞特异性,利用血清饥饿诱导研究内皮细胞自噬的分子机制比较困难.因此,寻找正常培养条件下血管内皮细胞的自噬诱导剂对深入了解其自噬机理具有重要意义。 在我们实验室的前期工作中,发现一种新型苯并噁嗪衍生-2,3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-1,4-苯并噁嗪(ABO)能够抑制血清饥饿和氧化型低密度脂蛋自诱导的VEU调亡。此外,ABO可以通过土调膜联蛋自A7(Annexin A7,ANXA7),促进ANXA7与微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain3,LC3)和粒钙蛋白(grancalcin, GCA))相互作用,促进正常培养的内皮细胞发生自噬。这些研究结果说明ABO是一种良好的内皮细胞保护剂和自噬诱导剂。但是ABO调节血管内皮细胞自噬的具体机制还不清楚。ANXA7具有钙离子依赖的GTPase活性,ANXA7的磷酸化与其GTPase活性的调节密切相关,并且直接影响ANXA7和其它蛋白的相互作用。LC3的脂化是自噬发生的核心环节。最近研究表明,12位丝氨酸是LC3上新发现的一个磷酸化位点,这一位点的磷酸化会抑制LC3的脂化,此外有研究表明,168位丝氨酸残基是GCA上一个可能的磷酸化位点。那么,ABO是否直接靶向ANXA7,能否调节ANXA7及其相互作用蛋白的磷酸化,以及在体内,ABO是否能发挥保护内皮细胞,抑制动脉硬化发展的作用还不清楚。 磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C (Phosphatidylcholine-specific Phospholipase C, PC-PLC)与内皮损伤和动脉硬化的发展密切相关PC-PLC的结合蛋白—磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(phosphatidylethanolamine binding plotein I,PEBP1)是一种重要的细胞信号转导因子在动脉硬化过程中,ANXA7与PC-PLC和PEBP1的关系还需要进一步的研究 据上述背景,本论文旨在利用ABO研究血管内皮细胞自噬和动脉粥样硬化发生发展的调节机制,为阐明VEC自噬的调控机制提供新的实验证据,为治疗动脉粥样硬化提供先导化合物和新靶点 1.新型苯并噁嗪衍生物ABO促进血管内皮细胞自噬分子机制的研究 1.1ABO靶向ANXA7,并抑制ANXA7的磷酸化 首先我们利用免疫沉淀的方法发现ABO以浓度依赖的方式抑制ANXA7与其抗体的结合,而不影响Cherry抗体与Cherry-ANXA7融合蛋白的结合,表明ABO直接与ANXA7结合,这一结合抑制ANXA7抗体与ANXA7的结合。此外,我们还发现ABO可以抑制ANXA7苏氨酸残基的磷酸化水平。通过定点突变,我们发现286位苏氨酸残基是ANXA7一个重要的磷酸化位点,ABO直接靶向份佑佐位苏氨酸残基,可能抑制了该位点的磷酸化 1.2ABO抑制ANXA7相互作用蛋白的磷酸化 我们之前研究结果表明,ANXA7与GCA和LC3存在相互作用,并且ABO可以促进ANXA7与LC3的相互作用。(在本实验中我们利用免疫荧光共染法发现在体内外,ABO均可以促进ANXA与GCA的相互作用。此外,通过免疫沉淀和western blot检测,我们发现ABO和ANXA7knockdown均可以有效地抑制GCA和LC3的磷酸化2.新型苯并噁嗪衍生物ABO抑制apoE-/-小鼠动脉硬化发展和促进斑块稳定的分子机制研究2.1ABO抑制apoE-/-小鼠动脉硬化发展并提高斑块稳定性 我们随机挑选。一批八周龄apoE-雄性小鼠,高脂饲料喂养14周。在22周处死基准组小鼠,其他三组分别腹腔注射不同剂量ABO或无菌Ⅰ)MSO和PBS,处理8周后处死,收集小鼠主动脉、头臂动脉和血液备用。组织形态学分析表明:ABO处理组小鼠整条血管,以及头臂动脉处和主动脉窦处的斑块面积均小于对照组Masson胶原纤维染色显示;ABO处理组小鼠主动脉窦处斑块内胶原含量大于对照组;免疫荧光结果显示:ABO处理组小鼠的主动脉窦处斑块内巨噬细胞含量小于对照组,平滑肌细胞含量大于对照组;原位组;原位明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶活性结果显示:ABO处理组小鼠的主动脉窦处斑块内基质金属蛋白酶-2/9的活性低于对照组TUNEL染色和HE染色显示:ABO处理组小鼠斑块中细胞凋亡率和坏死程度均显著低于对照组。此外,为了检测ABO的副作用,我们对小鼠进行体重跟踪和脏器系数分析,结果表明各组别小鼠之间没有显著差异。综上说明,ABO抑制动脉硬化斑块的发展,并提高斑块的稳定性。 2.2ABO抑制apoE小鼠动脉硬化发展并提高斑块稳定性的机制研究 首先,我们发现ABO对小鼠血脂含量没有影响。然后,我们利用透射电子显微镜和en face免疫荧光观察主动脉内皮细胞中自噬小体结构以及LC3的点状分布,结果发现ABO可以促进斑块内皮细胞发生自噬。此外,免疫荧光染色还显示:ABO处理组小鼠内皮细胞中p62的蛋白水平显著低于对照组,说明体内注射ABO促进斑块内皮细胞发生自噬,且自噬流是完整的。通过TUNEL染色和HE染色,我们发现ABO显著降低斑块内皮细胞的凋亡率,说明ABO发挥保护斑块内皮细胞的作用。 与之前的体外实验一致,ABO显著提高斑块内皮细胞中ANXA7的水平。此外,ABO处理还可以降低斑块内皮细胞和血清中PC-PLC的水平和活性。体外实验表明ABO抑制oxLDL诱导的内皮细胞对IL-6和IL-8的分泌,并可以促进ANXA7与PC-PLC相互作用抑制PC-PLC的活性。PC-PLC相互作用蛋白PEBP1参与到多种疾病中。我们发现随着动脉硬化的发展,斑块内皮细胞和血清中PEBP1的水平显著升高,ABO显著抑制其升高。


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