NAC1/FOXQ1分子通路在上皮性卵巢癌发生发展中的作用及机制研究

【摘要】：卵巢癌是第八大妇女最常见的恶性肿瘤,每年全世界新增诊断为卵巢癌的病例约有225,000例；卵巢癌也是致死率最高的妇科恶性肿瘤,死亡率约为140,000例/年。虽然,早期卵巢癌(Ⅰ期和Ⅱ期)预后较好,但大多数妇女就诊时,已经处于卵巢癌晚期(Ⅲ期和Ⅳ期),此时5年存活率只有40%左右。究其原因,现在对于卵巢癌的分子发病机制还不是很清楚,针对卵巢癌现在还没有一种敏感性及特异性好的早期筛查方法。而对于卵巢癌的治疗,虽然手术联合一线以铂类和紫杉醇为主的化疗,使病人的初治反应率可以达到80%左右,但几乎所有病人最后都会复发。现在也有许多针对卵巢癌的分子靶向治疗方法,但迄今为止,临床试验仍未发现疗效优于以铂类药物为主的联合治疗方案。 在过去的几年中,学术界对卵巢癌及其前体病变的认识发生了根本性的转变,越来越多的证据表明,原来被认为是一种单一体疾病的卵巢癌,实际上是由多个无论是在形态、病理生理、分子改变和临床进展方面均不同的个体肿瘤所组成的混合体。而卵巢癌中所占比例较高的上皮性卵巢癌从大的方面又划分为两型,每一型又分为不同的亚型。Ⅰ型卵巢癌包括卵巢低级别浆液性癌、低级别内膜样癌、透明细胞癌、粘液性癌及Brenner肿瘤。此型肿瘤发现时往往处于疾病早期,进展缓慢,经常表现为一种从良性病变渐渐发展成交界性病变最后进展为恶性病变的过程。此型肿瘤细胞基因组相对稳定,常见的基因突变有KRAS、BRAF、ERBB2、CTNNB1、PTEN、PIK3CA、ARID1A及PPP2R1A。Ⅱ型卵巢癌主要包括卵巢高级别浆液性癌、高级别内膜样癌、未分化癌及混合性中胚层癌。临床进展迅速,恶性度高,侵袭性强,病人就诊时往往已处于疾病晚期。分子表型特征性改变是常见的TP53基因突变及基因组染色质不稳定性。大量研究表明,卵巢高级别和低级别浆液性癌的前体病变极有可能均源于输卵管上皮,而非卵巢表面上皮,尤其是发病率相对最高的卵巢高级别浆液性癌,其前体病变很可能是输卵管伞端的浆液性输卵管上皮内癌变(STIC)。卵巢内膜样癌和透明细胞癌,虽然它们各自导致肿瘤发生发展的分子通路不同,但其前体病变均被认为与子宫内膜异位症病灶相关。 之前大多数的研究将卵巢癌视为一种疾病,新的卵巢癌分型和起源学说为进一步探索卵巢癌发生发展的分子机制提供了良好的理论依据和指导方向。全面掌握介导不同类型卵巢癌进展的相关分子通路知识,将会十分具有临床转化医学意义。已发表的研究表明,NAC1分子可以通过多方面机制调控上皮性卵巢癌发生发展及化疗耐药等表型,但至今对NAC1如何介导这些促肿瘤机制发生仍不清楚。基于此,本课题首先利用转录组学,发现NAC1可能的下游调控基因,最后选取FOXQ1作为进一步的研究对象,通过下述两个方面阐述NAC1/FOXQ1分子通路在上皮性卵巢癌发生发展过程中的作用。 第一部分NAC1在上皮性卵巢癌中对FOXQ1的调控机制研究 研究背景和目的： 近年来,关于BTB/POZ家族成员基因介导肿瘤发生发展的报道越来越多,BTB结构域(也称为POZ结构域)是介导蛋白相互作用的重要结构域,含有BTB结构域的蛋白通过形成二聚体或低聚体分子,来调节众多细胞生物学功能。本课题组前期利用基因表达连续分析(SAGE)技术,研究130个BTB家族成员基因发现,NACCl(nucleus accumbens-associated1)是一个新的潜在的肿瘤相关BTB/POZ家族基因。NACCl基因编码细胞转录因子NAC1的表达,其定位于人染色体区Ch19p13.2。分析人类肿瘤基因组图谱TCGA (The Cancer Genome Atlas)数据库显示,约18%卵巢高级别浆液性癌存在此区域的基因拷贝数扩增。统计学分析也证实,NAC1mRNA表达水平和基因拷贝数呈正相关(R0.54)。所以,NAC1过表达是卵巢浆液性癌发生的一个重要的分子基因改变表型。现在众多研究还发现,NAC1在多种肿瘤细胞中存在过表达状态,如宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、乳腺癌和结直肠癌等。 利用免疫组化技术研究NAC1在卵巢组织中的表达情况发现,卵巢正常上皮细胞无NAC1着色,而在卵巢癌细胞中,随着病理级别的升高,NAC1表达逐渐增强。NAC1在卵巢浆液性癌中的表达约为50%,显著高于其他卵巢癌组织类型。相对于NAC1低表达的卵巢癌病例,NAC1过表达病人的总生存率和无疾病生存率均显著下降。分子细胞学水平研究表明,NAC1具有促进肿瘤发生,维持肿瘤细胞生长,抑制肿瘤细胞凋亡的作用。它还影响肿瘤细胞的转移和侵袭能力,参与HMGB1介导的肿瘤细胞自噬反应,介导肿瘤细胞衰老等。NAC1不但调节肿瘤发生发展的过程而且还影响肿瘤对化疗的反应,可以介导卵巢癌细胞出现化疗耐药表型,是影响卵巢癌生物学行为的一个重要的相关分子。 然而对于NAC1如何发挥其转录因子的功能,如何通过调控下游基因介导上述肿瘤生物学表型发生的机制,至今还不是很清楚。本课题利用比较转录组学的方法,研究卵巢癌细胞中NAC1调控的基因,并探讨其在肿瘤细胞中所介导的NAC1生物学作用,以期对NAC1信号通路有一个更好的把握,为将来进行基于NAC1分子的靶向治疗研究提供新的理论依据。 研究方法和结果： 通过比较NAC1高表达或沉默的人卵巢癌细胞株SKOV3细胞不同基因表达谱,我们发现NAC1降表达后,细胞凋亡相关基因表达上调,而影响细胞生长、增殖、转移的信号通路,NOTCH信号通路及上皮细胞间充质转化(EMT)信号通路的相关基因表达下调。NAC1的下游调控基因有FOXQ1, FOXA2, JAGGED1, NOTCH1, IGFBP6, DBNL, DVL1, SNF2H及KBTBD8等。这些基因中,最后选取与肿瘤细胞转移侵袭能力相关的FOXQ1分子来进行进一步研究。结果发现,NACC1基因沉默后,FOXQ1的表达及启动子活性明显降低。诱导NAC1的BTB结构域从而抑制NAC1二聚体形成而降低NAC1分子活性,FOXQ1表达也会降低。而在不表达NAC1的转基因小鼠原代培养细胞中,异位表达NAC1会相应地增加FOXQ1分子的表达。从而在不同的角度,验证了NAC1分子对FOXQ1分子的调控作用。表型研究发现,利用基因沉默的方法降低NAC1表达后,肿瘤细胞的转移和侵袭能力明显降低,而异位表达FOXQ1可以在一定程度上逆转这一细胞学表型,显著增加细胞的移动能力,这说明FOXQ1参与了NAC1分子对卵巢癌细胞移行能力的调控。在高级别浆液性卵巢癌中,通过生物信息学挖掘,我们还发现NACC1基因和FOXQ1基因存在显著的表达共上调关系,进一步证实了NAC1/FOXQl分子通路在上皮性卵巢癌中的重要作用。 研究结论和意义： 本研究通过阐述卵巢癌细胞中NAC1分子调控的转录组,揭示了参与NAC1信号通路的重要肿瘤相关分子通路。通过阐述NAC1分子在基因表达及活性调控层面对FOXQ1分子的作用,进一步揭示了FOXQ1分子在NAC1信号通路介导的肿瘤细胞转移和侵袭过程中的重要功能。为未来开展针对NAC1过表达肿瘤进行的转化医学研究提供了良好的理论依据。 第二部分FOXQ1在上皮性卵巢癌发生发展中的作用机制研究 研究背景和目的： 上述研究表明,在卵巢高级别浆液性癌中,与肿瘤发生发展和耐药相关的重要基因NACC1可以显著上调其下游基因FOXQ1的表达,而异位表达FOXQ1可以部分逆转由于NAC1下调所导致的肿瘤细胞转移、侵袭能力降低。从而提示,FOXQ1可能在卵巢癌发生发展过程中也具有一定的作用。FOXQ1属于Forkhead box (FOX)转录因子家族,此家族分子的共同特征是含有一段保守的由110个氨基酸组成的序列,该序列通过与DNA特异结合而发挥其生物学调控功能。FOX家族至少有17个亚家族,包含至少43种不同的分子。FOX家族分子参与多种生物学活性的调控,如细胞代谢、个体发育、细胞分化、细胞增生、凋亡等。而FOX家族成员FOXO, FOXM, FOXP, FOXC, FOXA和FOXQ,均被报道与多种肿瘤的发生发展过程相关。 2001年首次确定并分离出FOXQ1分子,其由FOXQ1基因编码,是一段由403个氨基酸组成的蛋白分子。研究发现,此分子在胚胎干细胞和脊椎动物发育过程中起重要作用,通过接受HOXA1和HOXC13基因的调控作用来行使生物学功能。另外,FOXQ1在调节上皮细胞间充质转化(EMT)过程中也具有重要功能,此过程与肿瘤细胞的侵袭和转移能力密切相关。临床研究表明,FOXQ1上调与结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌病人的不良预后显著相关。虽然FOXQ1在肿瘤生物学中具有重要作用,然而至今仍没有关于FOXQ1与卵巢癌病理生理发展的相关研究和报道。基于此,我们进行了FOXQ1在上皮性卵巢癌发生发展过程中可能参与的分子机制研究。 研究方法和结果： 通过分析上皮性卵巢癌基因表达微阵列数据库。我们发现,无论在Ⅰ型或Ⅱ型上皮性卵巢癌,FOXQ1分子均呈高表达状态。与正常卵巢上皮细胞相比,FOXQ1在卵巢透明细胞癌、内膜样癌、粘液性癌及高级别浆液性癌中的表达均显著升高,结果具有统计学意义(分别是：p0.01,p0.0001,p0.01,和p0.0001)。与正常的输卵管上皮相比,FOXQ1在内膜样和高级别浆液性卵巢癌中的高表达具有显著差异(分别是：p0.001和p0.0001)。利用实时定量PCR检测9种卵巢癌细胞系中FOXQ1的表达情况,结果再次证明,FOXQ1在所有的卵巢癌细胞系中均表达升高且差异显著(p0.01)。之后,我们以高表达FOXQ1分子的人卵巢癌细胞系SKOV3作为实验模型,利用RNA干扰的方法,分析FOXQ1在卵巢癌发生发展过程中可能参与的生物学机制。发现FOXQ1分子降表达后,卵巢癌细胞增生和克隆形成能力明显降低；细胞周期相关调节因子表达发生明显改变；细胞的转移和侵袭能力减弱；上皮性细胞分子标志物表达升高,间质性细胞分子标志物表达下降。 研究结论和意义： 本研究表明FOXQ1分子在上皮性卵巢癌组织中呈高表达状态,并且会促进卵巢癌细胞增殖、转移侵袭和进行上皮细胞间充质转化的能力。鉴于FOXQ1分子在上皮性卵巢癌发生发展过程中所参与的多种重要的肿瘤生物学调控机制,其有望成为未来卵巢癌分子靶向治疗的一个新的生物学靶标。