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蓝藻光合作用捕光色素蛋白复合物一藻胆体的组装机制及功能调节

张楠  
【摘要】:藻胆体是蓝藻和红藻中重要的捕光色素蛋白复合物,由连有色基的藻胆蛋白和无色的连接蛋白组成,其主要功能是吸收和传递光能。不同的藻胆蛋白在连接蛋白的介导下有序组装形成藻胆体。目前对于藻胆蛋白的研究已经非常深入,但连接蛋白的研究进展却相对较慢。在已有文献中,只有一个核连接蛋白的晶体结构被报道。连接蛋白在藻胆体中行使连接和定位藻胆蛋白、修饰光能传递等重要功能,因此研究连接蛋白与藻胆蛋白的相互作用对于深入理解藻胆体的结构与功能是非常必要的。除了吸收传递光能外,藻胆体在能量调节方面也发挥着重要作用。蓝藻中的藻胆体被报道可以通过移动的方式对光能在两个光系统间的分配进行调节,然而,蓝藻中多样性的类囊体膜结构以及相邻类囊体膜间的狭窄距离可能会阻碍藻胆体在类囊体膜表面的长距离快速移动。因此,蓝藻藻胆体是否具有长距离快速移动的特质仍有待在更为丰富多样的蓝藻种类中加以研究,对这一问题的深入探讨将有助于我们对蓝藻中藻胆体参与的能量调节及耗散机制有更加准确的认知。因而围绕藻胆体的结构与功能这一主题,本论文开展了多方面的工作,取得的研究结果如下: 1.单细胞蓝藻的FRAP研究 光漂白后荧光恢复(Fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)技术是一种利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子的分布、迁移及其它动态特性的技术。在本文中,我们选择了两株单细胞蓝藻Synechococcus sp. WH7805(以下简写为WH7805)和Synechococcus sp. PCC7002(以下简写为P7002)为研究对象,对体内以及离体状态下的藻胆体进行了FRAP研究。早期的文献报道,WH7805和P7002具有不同的藻胆蛋白组成,前者由藻红蛋白(Phycoerythrin, PE)、藻蓝蛋白(Phycocyanin, PC)和异藻蓝蛋白(Allophycocyanin, APC)组成(我们将藻胆蛋白组成为PE+PC+APC的蓝藻定义为PE型蓝藻),而后者仅含有PC和APC(我们将藻胆蛋白组成为PC+APC的蓝藻定义为PC型蓝藻)。根据其不同的藻胆蛋白组成,我们选择555nm和639nm的激光来分别激发WH7805藻胆体末端的PE以及P7002藻胆体末端的PC。在天然状态下,两种蓝藻细胞进行光漂白后,其荧光都有不同程度的部分恢复。进一步用蛋白交联剂戊二醛对细胞进行预处理,藻胆体被固定在类囊体膜原位而无法移动,在这种情况下两种细胞的荧光仍可以部分恢复,但恢复程度比类似漂白深度下的天然细胞的恢复略低,这可能是由于戊二醛处理对藻细胞本底荧光的影响。同时,我们提取了两种蓝藻的藻胆体以及藻胆体-类囊体膜,使用光谱学手段对两类样品进行了完整性检验,并在此基础上对两类样品进行了戊二醛固定,继而对固定后的藻胆体以及固定前后的藻胆体-类囊体膜进行了同样的FRAP研究,荧光仍然可以部分恢复。通过计算FRAP实验过程中两种藻细胞在固定前后的平均荧光恢复比例并辅以Unpaired Student's t-test统计学分析,结果表明在类似的漂白深度下同一种细胞固定前后的荧光恢复比例没有显著差异(P0.05)。因此,藻胆体在不可能移动的情况下荧光仍然可以恢复的现象表明,两株单细胞蓝藻中藻胆体的荧光恢复并非藻胆体的长距离迁移造成的。由于荧光分子具有光漂白后荧光可逆恢复的特性,因此这种荧光恢复是其内在光物理过程的体现。2.丝状蓝藻的FRAP研究 为了探究这种固有的荧光恢复现象在蓝藻中是否具有普遍性,我们又选取了两株来自不同生境的丝状蓝藻作为材料,使用FRAP技术对两种蓝藻藻胆体的荧光动力学进行了分析。两株藻分别为分离白北极海冰的Pseudanabaena sp.0831(以下简写为P0831)以及淡水来源的Pseudanabaena sp. FACHB-1277(以下简写为F1277)。由于本章所选择的两株丝状蓝藻分离自野生环境,未有文献报道其藻胆蛋白组成。因此,我们首先对其藻胆蛋白组成进行了分析,通过测定两株蓝藻细胞悬液的吸收光谱,并与WH7805和P7002的吸收光谱进行比较,证实P0831为PC型蓝藻,F1277为PE型蓝藻。基于藻胆蛋白的组成,我们选择555nm和639nm的激光来分别激发F1277中藻胆体末端的PE以及P0831藻胆体末端的PC。天然状态下,光漂白后两种丝状蓝藻的荧光都有不同程度的恢复。在经过戊二醛固定后,蓝藻细胞的荧光仍可以恢复,恢复程度同样略低于类似漂白深度下的天然细胞的恢复。同时,我们提取了两株蓝藻的藻胆体以及藻胆体-类囊体膜,使用光谱学手段对两类样品进行了完整性检验,并在此基础上对两类样品进行了戊二醛固定,继而对固定后的藻胆体以及固定前后的藻胆体-类囊体膜进行了同样的FRAP研究,荧光仍然可以部分恢复。通过计算FRAP实验过程中两种藻细胞在固定前后的平均荧光恢复比例并辅以Unpaired Student's t-test统计学分析,结果表明在类似的漂白深度下同一种细胞固定前后的荧光恢复比例没有显著差异(P<0.05)。基于以上体内及体外、定性及定量的实验结果,我们认为丝状蓝藻中的荧光恢复同样是藻胆体原位内在的光物理过程,这一点与单细胞蓝藻中的结论是一致的。 3.蓝藻藻胆体杆组装的分子机制 pfam00427结构域是连接蛋白中分布最广且最为保守的一类结构域,但对其结构和功能的研究却鲜有报道。本实验室已在前期研究中解析了pfam00427结构域的晶体结构。本部分在pfam00427结构域晶体结构解析的基础上,通过生化突变实验和分子动力学模拟等手段研究了蓝藻藻胆体杆组装的机制。 为了研究pfam00427结构域如何结合在C-PC (αβ)6的中央空腔内,我们运用AutoDock软件实现了pfam00427与C-PC (ap)6的刚性对接,进而对输出的众多pfam00427-C-PC (αβ)6七聚体的结构模型进行打分,基于自由能值,选择了前14个模型进行下一步分析。依据pfam00427在C-PC(αβ)6内部空腔内的相对位置,将14个结构模型分为两组,每组7个结果。通过比对发现,两组之间的pfam00427的相对位置相对于垂直轴有一个大约30°的旋转,而每组内不同模型之间的差别较小。究竟哪一种更接近天然藻胆体的组装方式,我们进一步通过生化验证的手段加以区分。根据生物信息学预测,我们对pfam00427上可能涉及与C-PC相互作用的关键氨基酸进行了定点突变,构建了一系列的突变体。将pfam00427及其突变体融合GST标签蛋白重组表达,利用一种改进的GST pull-down方法检测pfam00427与C-PC的相互作用。将GST-pfam00427及其突变体与C-PC分步透析至4M尿素溶液中,再分步透析至不含尿素的磷酸缓冲液中。此外,我们对尿素变复性前后两种蛋白的性质进行了检测,相关光谱结果表明变复性前后C-PC的光谱性质保持稳定,pfam00427及其突变体蛋白的二级结构基本保持不变。此外,对照实验结果表明C-PC不能非特异性结合凝胶颗粒或者GST标签蛋白。通过这种改进的GST pull-down检测,我们找到了7个有效突变位点,鉴定出pfam00427上一片保守的"C-PC结合区域”,该区域主要与C-PC (αβ)3的p3亚基相互作用。基于上述生化结果,我们从两组模型中选择了满足上述条件的第一组模型,并从该组的7个模型中选择了最为合理的一个模型,进行了分子动力学模拟,得到了pfam00427-C-PC (αβ)6七聚体的最终结构模型,并通过定点突变对该模型进行了验证。 进一步地,我们把同源模建的LRT(即pfam01383结构域)通过分子对接放入到pfam00427-C-PC (αβ)6七聚体模型中,得到了蓝藻藻胆体杆的最基本组成单元pfam01383-pfam00427-C-PC (αβ)6八聚体的模型,并在此基础上提出了蓝藻藻胆体杆组装的精细分子模型。在这个模型中,连接蛋白LR串联两个(αβ)6六聚体,这很好地解释了连接蛋白是如何介导藻胆体杆的组装的,从蛋白质分子的结构层面上揭示了藻胆体杆的组装机制,对前人提出的模型进行了修正和细化,对于进一步了解整个藻胆体的组装方式具有重要意义。4.蓝藻藻胆体连接蛋白LCM氮端结构域pfam00502的结晶及优化 LCM位于蓝藻藻胆体的核心部分,是末端能量受体(αβ)2(LCMβ18)(Terminal Energy Acceptor, TEA)的重要组成部分,其氮端具有一个藻胆蛋白类似结构域pfam00502。本实验室前期的研究已经对pfam00502结构域自色素化的机制以及TEA的能量传递进行了阐述。然而,由于缺乏pfam00502结构域的结构信息,对其自色素化的过程以及其参与核心部分与PSⅡ的组装基础尚不清楚。本部分试图对脱辅基蛋白(apo-pfam00502)以及色素化蛋白(PCB-pfam00502)的晶体结构进行解析,以详细阐述pfam00502是如何完成自色素化的。 我们首先重组表达了模式蓝藻Synechocystis sp. PCC6803中pfam00502结构域的脱辅基蛋白(apo-pfam00502),然后对其进行了蛋白纯化和结晶。我们经过初筛已得到一个apo-pfam00502的晶体,对其结晶条件的进一步优化尚在进行中,还未获得可以用于衍射的理想晶体。apo-pfam00502的结晶难度主要在于缺少PCB分子而很难维持构象的稳定性。我们也经过多轮尝试以期获得PCB-pfam00502的晶体,但未能如愿。这可能与其体外自色素化不完全而导致的样品性质不均一有关;另外,PCB-pfam00502的成熟是否需要其他修饰尚不清楚,这同样是可能导致PCB-pfam00502没有晶体生长的原因之一


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