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Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3在人脑胶质瘤中的表达

樊明德  
【摘要】:胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞,是中枢神经系统中最常见肿瘤,据统计脑胶质瘤占中枢神经系统原发肿瘤的40-50%。与其他部位常见肿瘤相比,胶质瘤发病率较低。然而,胶质瘤却有着极为不成比例的发病率和死亡率,目前总体预后不佳。随着医学免疫学的发展,大量研究发现人体免疫系统与肿瘤的发生发展有着密切关系。Nod样受体(Nod-like receptor, NLR)作为一种胞内模式识别受体,具有识别入侵病原体和激活先天免疫反应的重要功能,是一类细胞内感应分子。NLRP3作为NLR家族成员之一,在多种疾病的防御和发生过程中具有重要作用。NLRP3可以调节IL-1β和IL-18的成熟与分泌,在多种肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。IL-1β和IL-18这两个紧密相关的IL-1家族细胞因子对宿主免疫反应起着关键调控因子的作用,同时在人脑胶质瘤的发生发展中发挥重要作用。目前NLRP3在胶质瘤中的表达以及对于预后的指导意义报道较少。 研究目的 1.研究Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(Nod-like receptor pyrin domain-containing protein3, NLRP3)在人脑胶质瘤组织中的表达。 2.探讨NLRP3在人脑胶质瘤的发生、发展中的作用。为治疗胶质瘤寻找新的靶点提供理论依据。 研究对象及方法 1.研究对象 按照2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类及分级标准,将所收集的49例人脑胶质瘤组织根据其病理类型分为低级别组(20例)和高级别组(29例),并收集脑外伤后行颅内减压手术切除的正常脑组织10例做对照。 2.研究方法 2.1免疫组织化学(Immunohistochemistry)法检测NLRP3表达量及组织定位蜡块包埋组织,3μm连续切片,二甲苯脱蜡2次,5~10min/次,梯度酒精水化,EDTA抗原修复液(pH9.0)高压修复2min,待组织切片自然冷却后PBS洗1次。滴加浓度为1:100的单克隆抗体NLRP3(Ⅰ抗),4℃孵育过夜。PBST洗3次,5min/次,滴加羊抗鼠的Ⅱ抗,37℃孵育45min, PBST洗3次,5min/次。DAB(1:50)显色,苏木素复染30sec,中性树胶封片。正常脑组织切片作为对照。 2.2免疫印迹(western blot)法检测NLRP3在蛋白水平表达 从-80℃冰箱中取出正常及胶质瘤组织加入裂解液与蛋白酶抑制剂,研磨后超声震碎,15000×g/min,离心10min,离心半径13.5cm,4℃,上清液转移到新的EP管中,做标记,BCA测定,并调整蛋白浓度,蛋白样品中加入1/6体积的蛋白上样缓冲液,煮沸10min。加样于配好的SDS凝胶,积层胶90V,进入分离胶后110V,切胶,转膜,封闭用1%的BSA,室温1.5h。一抗孵育,4℃过夜。1X TBST洗10min,重复3次,二抗(1:5000)37℃孵育1h,1X TBST洗10min,重复3次,显色。 2.3实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测NLRP3在mRNA水平表达 根据Invitrogen公司Total RNA提取kit说明书完成。紫外分光光度计测定各样本的RNA浓度。按照Ferments逆转录试剂盒说明书,逆转录体系为20μL,逆转录每个样本RNA1μg,引物选择oligo(dT)1μL,5X Reactin Buffer4μL,10Mm dNTP Mix2μL,RibolockTM Rnase Inhibitor1μL,RevertAiTMM-MuLV Reverse Transcriptase1μL,RNase-free water (0~11μL)反应条件:65℃孵育5min,42℃,60min,70℃5min.QRT-PCR检测目的基因及内参:反应体系为25μL:(2x)SYBR Green qPCR master mix12.5μL,Template cDNA2μL,Forward Primer1μL,ReversePrimer1μL, nuclease-free Water8.5μL反应条件:预变性95℃5min,55℃退火1min,68℃延伸30s,40个循环。 研究结果 NLRP3在正常脑组织中表达不明显,在低级别胶质瘤中表达较少,在高级别胶质瘤中表达明显,组间比较差异有统计学意义(P0.01)。人脑胶质瘤组织中NLRP3在mRNA水平及蛋白水平均高于正常脑组织(P0.01)。NLRP3的表达与人脑胶质瘤的恶性程度呈正相关。 结论 1、人脑胶质瘤中存在NLRP3的异常表达,其表达量随胶质瘤恶性程度的升高而增加。 2、NLRP3在人胶质瘤的发生和侵袭中可能发挥着重要的作用。 3、检测NLRP3的表达有助于胶质瘤分化程度的判断。 创新点及意义 1、本研究首次检测了NLRP3在人脑胶质瘤组织中的表达情况,发现其随着肿瘤病理级别的升高而增加。据此预测其可能在胶质瘤的发生及发展过程中发挥重要作用。 2、我们可以通过测定NLRP3的表达量推测脑胶质瘤的发生与否及其良恶程度,对临床诊断和预后有一定的指导意义。 3、NLRP3可能成为治疗胶质瘤的一种新的靶点来延缓病情进展甚至取得较好的疗效。


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