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Sorangium cellulosum So0157-2纤维素降解酶的性质与功能分析

林小瑜  
【摘要】:粘细菌(myxobacteria)是一类能够进行滑行运动的革兰氏阴性杆菌,具有复杂的多细胞社会学行为,可以形成种类丰富、功能多样的生物活性物质。根据对生物大分子的降解特性,粘细菌可以分为两大类群:溶纤维素类群和溶细菌类群。溶纤维素类群中一个重要的属为堆囊菌属,而纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)是其中的模式种。 纤维堆囊菌(S. cellulosum)能够在以结晶纤维素滤纸为唯一碳源的无机盐培养基中生长,并伴随着有效的细胞接触性的滤纸降解。纤维堆囊菌的纤维素降解特性是其生长发育的物质基础,是其产生生物活性物质的基础,是分离纯化的依据,也是其分类的重要依据。但目前对S. cellulosum降解纤维素这一特性的研究却鲜有报道。 实验室前期研究发现,S. cellulosum降解纤维素过程依赖于菌体与底物的相互接触,进而以完整洗涤细胞建立反应体系可检测到明显的内切葡聚糖酶和木聚糖酶活性,表明其相关降解酶组分与细胞结合在一起。但其中的酶组分在菌体上的组织方式,仍没有得到明确解析。此外,酶组分与细胞的结合方式使得S.cellulosum中纤维素酶、木聚糖酶等单酶组分的分离纯化非常困难,限制了对单酶组分生化性质的研究及纤维堆囊菌纤维素降解机制的研究。实验室前期对S.cellulosum的研究及纤维素酶特征的分析,发现S. cellulosum在降解纤维素过程中所采用的策略与目前已有研究的几种策略均不相同。S. cellulosum在降解纤维素过程中可能具有自己独特的降解策略。 本论文的工作在实验室对S. cellulosum So0157-2测序的基础上,对单个纤维素酶组分通过基因克隆、异源表达获得重组活性蛋白,一方面对单酶的生化性质进行分析,以了解其在该菌众多纤维素酶组分中的独特性和功能分工;另一方面可以为制备其对应的抗体提供材料,为研究S. cellulosum中纤维素酶的空间分布奠定基础。 本工作选择S. cellulosum So0157-2基因组中预测到的唯一的外切葡聚糖酶基因、两个糖苷水解酶5家族(GH5)的纤维素酶基因和一个GH9家族的含CBM结构域的内切葡聚糖酶基因,分别命名为ScCel6A、ScXEG5、ScCelS和ScCel9E。进行了基因克隆和表达,获得了纯化的活性蛋白,开展了酶学性质研究。 将ScCel6A连入表达载体pET-15b,成功构建表达载体pET-15b-ScCel6A,在E. coli BL21(DE3)中诱导表达,优化表达条件后成功获得可溶表达。对蛋白进行Ni亲和层析和超滤获得了活性目的蛋白,蛋白纯度达至电泳纯。对r-ScCel6A酶学性质进行分析发现,其最适pH为6.0;最适温度为45℃。具有较强的碱耐受性,在pH10的缓冲液中室温处理18h后,仍能够保留60%以上的活性。较为适应低温常温环境,不能耐受较高温度,在55℃反应时,酶活性便基本完全丧失。Ca2+Pb2+和Mn2+以1mM浓度存在时,对酶活有微弱的促进作用。多种金属离子如Cu2+,Fe3+,Zn2+,Ag+和Hg2+对r-ScCel6A都有抵制作用,而金属离子螯合剂EDTA对酶活没有明显影响,可用于降低部分金属离子对酶活的抑制作用。DTT对酶活具有抑制作用。所检测多糖底物中,r-ScCel6A对PASC表现出最高的降解活性,不具有pNPC降解活性。r-ScCel6A对PASC的Km值为5.02mg/ml,Vmax为4.07μmolmin-1mg-1。作用于多糖的产物主要为纤维二糖,另外含有少量纤维三糖;对寡糖的降解类似,但纤维三糖的降解产物中检测到纤维二糖,未能检测到相应的葡萄糖,原因有待进一步研究。针对r-ScCel6A,制备了多克隆抗体,并对So0157-2不同组分进行了western blot细胞定位,结果显示,So0157-2中的外切葡聚糖酶ScCel6A主要存在于膜上,胞内和胞外也有部分存在。 将ScXEG5连入表达载体pET-22b,戊功构建表达载体pET-22b-XEG5。优化表达条件后成功获得可溶表达。使用Ni亲和层析对蛋白进行纯化。重组酶的最适底物为木葡聚糖,且唯一降解木葡聚糖,为一专一性降解木葡聚糖的内切葡聚糖酶(木葡聚糖酶)。r-XEG5最适pH在5.5—6.5左右,r-XEG5在pH4—12广泛范围内,经过室温18h的预处理,仍能够保持接近80%以上的酶活性,且pH仍有可继续上升的可能,具有很强的pH耐受性,能够耐受一定的极端环境。r-XEG5最适温度为55℃,不适宜温度更高的环境。Ca2+和Ni2+对酶活有一定的促进作用。Cu2+, Fe3+, Fe2+, Cr3+, Zn2+, Co2+, Mn2+, Ag+和Hg2+等对酶活均具有抑制作用。EDTA和DTT对酶活有一定的促进作用。 ScCelS的ORF长度为1,209bp,基因的G+C百分含量为67.49%,接近报道的粘细菌DNA的G+C百分含量(67-72%),基因编码一个含402个氨基酸残基的蛋白质,顶测的蛋白分子量为42.06kDa,理论等电点pI为5.48。SignalP分析表明,编码蛋白的N末端存在一个35个氨基酸残基的信号肽。ScCelS含有单一的纤维素酶催化域。PCR扩增ScCelS ORF中编码成熟蛋白的序列,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。重组蛋白以胞内可溶形式表达。经过镍柱亲和层析和透析,得到了电泳纯的有活性的重组蛋白r-ScCelS。重组酶的最适pH为7.5,最适反应温度为45℃,具有较强的pH耐受性及一定的热稳定性。高浓度(10mM)的Cu2+和Fe3+会使酶完全丧失活性,EDTA作为一种络合剂,可削弱这种抑制作用。ScCelS对β-1,4-linked glucan和1,3:1,4-β-D glucan均具有较强活性,且对1,3:1,4-β-D glucan的活性更高。ScCelS降解CMC的主要产物为纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖。 ScCel9E序列全长2382bp,G+C百分含量为69.77%,编码793aa,理论分子量为85kDa,理论等电点为6.67。SignalP分析预测该蛋白N端含有长34个氨基酸的信号肽。BlastP结果显示,该蛋白含有多个结构域,包括纤维素结合域CBM、可能的类Ig (immunoglobulin)结构域或类Ⅲ型纤连蛋白(fibronectin typeⅢ)结构域或homodimeric/tetrameric/dodecameric互作用结构域CelD-N、GH9家族催化域CD(catalytic domain)。为研究CBM结构域及CelD-N结构域的功能,我们进行了不同程度截短的目的蛋白异源表达,并进行了详细的性质分析。r-ScCel9E(含CBM、CelD-N、CD)的最适反应温度为35℃左右,0℃时的相对活性为30%左右,低温情况下活性较高,具有一定的冷适应性。该酶不耐高温,不具有热稳定性。r-ScCel9E的最适pH在6-7.5左右。在不同pH的磷酸盐缓冲液中预处理后,残余酶活均在60%以上,适宜在磷酸盐缓冲环境中储存。Li+,K+和Mg2+在较高浓度时对酶活有一定的促进作用;Ca2+的存在对酶活有一定的促进作用;DTT在高浓度时对酶活具有一定的促进作用。r-ScCel9E对1,3:1,4-β-D glucan (barley glucan和lichenan)表现出最高活性;另外,对β-1,4键连接的CMC和PASC的活性也较高。产物分析结果显示,r-ScCel9E为一个典型的内切葡聚糖酶,产物具有不同链长的寡糖,且不含单糖。r-ScCel9E-1(含CelD-N、CD,截掉CBM)的最适反应温度为30℃左右,相对于r-ScCel9E有所降低。在0℃时活性为最高活性的60%以上,具有很强的冷适应性,比r-ScCel9E高出一倍,更加适合于低温环境的工业生产应用r-ScCel9E-1的最适反应pH在6-7.5左右。r-ScCel9E-1和r-ScCel9E与不可溶底物结合能力相似,CBM的缺失没有明显降低酶与不可溶底物的结合能力。r-ScCel9E-2(含CD,截掉CBM和CelD-N)失去了纤维索降解活性,且在异源表达过程中包涵体表达明显增多。


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