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靶向mTORC1的新型丁内酯衍生物3BDO抑制oxLDL诱导的内皮细胞自噬和ApoE~(-/-)小鼠的动脉粥样硬化

彭楠  
【摘要】:研究背景和研究目的 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是最常见、最重要的一种血管病变,是心脏病、心肌梗塞和周围血管疾病发生的重要诱因,对人类的身体健康造成了极大的危害,主要表现为:脂质在动脉内膜上积聚形成粥样斑块,动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小,严重时斑块破裂可导致血栓形成进而引起急性冠状动脉综合症。关于AS的发病机制,目前有多种不同的解释包括脂质浸润学说、血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说等。但是有关该疾病的具体的病理机制还不清楚。 血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)位于血管壁的最内层,在心血管系统中具有非常重要的作用。VEC位于血液和组织之间,形成一层重要的屏障,参与调节胆固醇的代谢、信号转导、免疫、炎症以及调节血压、凝血与抗凝平衡等过程。内皮细胞功能紊乱是诱发动脉粥样硬化等心血管疾病的重要因素。近年来关于内皮细胞在动脉粥样硬化中的重要性的研究越来越多,并逐渐产生了一种新的AS发病机制学说“内皮损伤反应学说”,而内皮细胞也成为了治疗AS新的靶点。 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR),又被称为FK506结合蛋白12(FK506binding protein12, FKBP12)雷帕霉素相关蛋白1A,是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,隶属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI3K))蛋白家族。mTOR有两种复合体,分别是复合体1和复合体2(mTOR complexl,mTORC1;mTOR complex2, mTORC2),两者受很多上游因素的调节,包括生长因子、能量、压力以及营养条件,并参与多种细胞功能的调节,如细胞生长、增殖和代谢过程。mTOR的调控异常会诱发多种疾病,包括阿尔兹海默症、癌症以及糖尿病及其心血管并发症等。因此,mTOR已经成为很多疾病的治疗靶点,并在临床上得到了应用,mTOR的抑制剂已经成功的应用于癌症的治疗过程。 近年来,化学遗传学在寻找参与生理病理过程调控的新因子和新药开发中得到很好的应用。在前期工作中,我们实验室发现一种新型丁内酯衍生物3-苄基-5-(2-硝基苯氧甲基)-γ-丁内酯(3-benzyl-5-((2-nitrophenoxy) methyl)-dihydrofuran-2(3H)-one,3BDO)能够选择性的抑制由氯代奎宁以及脂多糖引起的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的损伤,是一种很好的内皮细胞保护剂,继而进一步鉴定3BDO为mTORC1的激动剂。但是,3BDO是否通过直接靶向mTORC1,抑制氧化性低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)引起的内皮损伤,以及在体内,3BDO是否具有保护内皮细胞和抑制动脉粥样硬化发展的作用还不清楚。 为了回答这些科学问题,本论文以HUVEC和apoE-/-小鼠为细胞和动物实验模型,研究了3BDO对oxLDL诱导的血管内皮细胞自噬和动脉粥样硬化发展的影响及其分子机制,旨在搞清mTORC1对血管内皮细胞功能和动脉粥样硬化发展的调节作用及其分子机制,为阐明血管内皮细胞自噬的调控机制提供新的实验证据,为动脉粥样硬化的防治提供新靶点和先导化合物。 研究结果 1.新型丁内酯衍生物3BDO激活mTORC1抑制oxLDL诱导的内皮细胞自噬的分子机制 1.1在HUVECs中,3BDO抑制了由oxLDL引起的mTORC1活性的下降 我们首先检测了内皮细胞中oxLDL刺激条件下,3BDO对mTORC1活性的影响,主要是检测了mTORC1下游的两个底物p70S6K和4EBP1的磷酸化。Western blot结果显示,oxLDL处理条件下,p70S6K和4EBP1的磷酸化水平明显降低,mTORC1被抑制,而加入3BDO处理明显的抑制了oxLDL的作用,促进了p70S6K和4EBP1的磷酸化,说明mTORC1被激活。 1.2在HUVECs中,3BDO抑制了由oxLDL引起的FLJ11812水平的升高 我们实验室的前期研究表明,长非编码RNAFLJ11812(long noncoding RNA FLJ11812,lncRNAFLJ11812)位于mTORC1的下游,mTORC1通过促进TIA-1的磷酸化抑制FLJ11812的产生。RT-PCR实验结果显示,在内皮细胞中,oxLDL引起FLJ11812水平明显上升,3BDO抑制了由oxLDL诱导的FLJ11812的产生。 1.3在HUVECs中,3BDO抑制了由oxLDL引起的ATG13蛋白水平的升高,促进其磷酸化 FLJ11812是通过与miRNA结合发挥翻译调控作用的长非编码RNA,它可以与miR-4459结合从而调节miR-4459靶向的基因ATG13的表达水平。Western blot实验结果显示,在内皮细胞中oxLDL诱导ATG13的水平明显升高,3BDO处理组ATG13蛋白水平明显降低,说明3BDO通过抑制FLJ11812的产生,抑制了ATG13的蛋白水平的升高。mTORC1的激活还可以直接促进ATG13的磷酸化,结果显示,oxLDL引起内皮细胞中ATG13的磷酸化水平降低,3BDO处理促进了ATG13的磷酸化。 1.4在HUVECs中,3BDO抑制oxLDL引起的内皮细胞自噬 ATG13是自噬起始所必须的因子,ATG13蛋白水平的降低及其磷酸化水平的升高均会导致自噬水平的下降。我们进一步检测了3BDO对内皮细胞中oxLDL诱导的自噬水平的影响。结果显示,在oxLDL处理条件下,内皮自噬水平明显升高,LC3-Ⅱ水平升高,p62积累,免疫荧光结果也显示oxLDL引起了LC3的点状聚集。而加3BDO则明显的抑制了LC3-Ⅱ水平的升高,p62的积累以及LC3的点状聚集,说明3BDO抑制了由oxLDL引起的自噬。 1.5在HUVECs中,3BDO抑制了由oxLDL引起的炎性因子水平的升高 oxLDL对内皮细胞的损伤会导致其分泌一系列的炎性因子,如粘附因子、白介素等。Western blot以及酶联免疫吸附分析结果表明,3BDO明显抑制了oxLDL引起的内皮细胞中ICAM-1/VCAM-1的蛋白水平以及分泌到细胞外的IL-6/IL-8的水平。 2.3BDO抑制了apoE-/-小鼠动脉硬化发展,促进了斑块的稳定性 2.13BDO降低了apoE-/-小鼠整条主动脉以及主动脉窦处的脂质积累 我们随机挑选一批八周龄apoE-/-雄性小鼠,高脂饲料喂养12周。然后分别腹腔注射不同剂量3BDO或DMSO,连续注射8周后处死,收集小鼠主动脉和血液备用。油红O染色结果显示,与对照组相比,3BDO处理组小鼠的整条主动脉以及主动脉窦处的脂质积累明显低于对照组。 2.23BDO抑制apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的发展,促进了斑块的稳定性 苏木精伊红染色结果显示,3BDO处理组小鼠主动脉窦处的斑块面积均小于对照组,说明3BDO抑制了斑块的发展。免疫荧光结果显示3BDO处理组小鼠的主动脉窦处斑块内巨噬细胞含量小于对照组,平滑肌细胞含量大于对照组;原位明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶活性结果显示3BDO处理组小鼠的主动脉窦处斑块内基质金属蛋白酶-2/9的活性低于对照组,说明3BDO促进了斑块的稳定性。 2.33BDO抑制动脉粥样硬化的炎症反应 动脉粥样硬化是一种慢性炎症反应过程,我们通过酶联免疫吸附分析法检测了3BDO对apoE-/-小鼠炎症反应的影响,结果表明,与对照组相比,3BDO处理明显降低了小鼠血清中炎性因子IL-6和IL-8的水平。 2.43BDO不影响apoE-/-小鼠体重的变化 此外,在小鼠腹腔注射期间我们对小鼠的体重进行了跟踪,发现各组小鼠之间体重没有显著差异,表明3BDO并没有对小鼠产生明显的毒副作用。 总之,3BDO能够抑制动脉粥样硬化斑块的发展,并提高斑块的稳定性。 3.3BDO抑制apoE-/-小鼠动脉粥样硬化发展和稳定斑块的分子机制 3.13BDO处理不影响apoE-/-小鼠的血脂水平 首先,为了观察3BDO是否通过调节脂代谢影响动脉粥样硬化的发展,我们检测了3BDO对小鼠血清中脂质含量的影响。结果显示,与对照组相比,3BDO处理组小鼠血脂含量没有发生明显的改变,说明3BDO并不参与调节脂质的代谢。 3.23BDO促进apoE-/-小鼠主动脉内皮层细胞mTORC1的激活 我们通过免疫荧光染色进一步检测了斑块内皮层中mTORCl的激活水平。与对照组相比,3BDO处理组斑块内皮层p-p70S6K的磷酸化明显升高,说明3BDO促进了apoE-/-小鼠斑块内皮层mTORC1的活性。 3.33BDO降低了apoE-/-小鼠斑块内皮层中ATG13的蛋白水平 通过免疫荧光染色检测了斑块内皮层中ATG13蛋白水平的变化。与体外实验相一致,结果显示,与对照组相比,3BDO处理组斑块内皮层中ATG13的蛋白水平明显降低。 3.43BDO选择性抑制apoE-/-小鼠主动脉内皮层细胞自噬的水平 En face免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,3BDO处理组apoE-/-小鼠血管内皮层中LC3点状聚集明显减少,说明3BDO抑制了血管内皮层自噬。 此外,western blot结果显示3BDO并没有对巨噬细胞和平滑肌细胞自噬水平产生明显的影响,说明3BDO是选择性的作用于内皮细胞。 3.53BDO抑制apoE-/-主动脉内皮层细胞的凋亡 TUNEL染色结果显示与对照组相比,3BDO处理组斑块内皮层细胞凋亡率明显降低,说明3BDO抑制斑块内皮层凋亡的发生。 综上所述,3BDO通过激活mTORC1抑制了血管内皮层自噬损伤及凋亡,进而抑制了动脉粥样硬化的发展,使斑块稳定。 结论 本研究表明,在血管内皮细胞中,oxLDL引起的mTORC1活性下降,促进了动脉粥样硬化的发展。首先,mTORC1活性的下降,促进了FLJ11812的产生,进一步上调ATG13的水平,促进了自噬的发生以及由自噬损伤引起的内皮凋亡,促进了斑块的不稳定性和动脉粥样硬化的发展。3BDO作为mTORC1的激动剂,抑制了oxLDL引起的mTORC1活性的下降,从而促进了斑块的稳定性、抑制动脉粥样硬化的发展。


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