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高碘对体外培养大鼠主动脉内皮细胞损伤作用的研究

邹晓燕  
【摘要】:目的 研究不同浓度碘对大鼠主动脉内皮细胞的增殖或促凋亡作用,探索高碘对动脉血管的损伤及致动脉粥样硬化的作用。 方法 大鼠主动脉内皮细胞置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期细胞进行实验。实验分为对照组和加碘组:加碘组碘浓度分别为3506mg/L4076mg/L、4647mg/L、5218mg/L、5789mg/L、6360mg/L、6931mg/L、7512mg/L,以空白作为对照组。连续培养48小时后收集细胞和细胞培养液待用,采用四唑盐(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法检测细胞活性;瑞氏-吉姆萨染色(Wrigh-Giema staining)观测细胞形态;吖啶橙荧光染色(Acridine orange staining)观测细胞凋亡形态。Annexin V-FICT/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。检测细胞培养液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione Peroxidase, GSH-px)活性,丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(Glutathiose, GSH)和蛋白质羰基(Protein carbonyls)含量。检测细胞培养液中内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nidtric oxide synthase, eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)活性。采用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymersade chain reaction, RT-PCR)检测细胞中eNOS-mRNA和iNOS-mRNA表达水平。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养液中血管细胞粘附因子-1(Vasular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间粘附因子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)含量。统计方法:组间比较采用方差分析,两两比较采用t检验,以P0.05为差异具有统计学意义。 结果 1MTT检测细胞活性 培养液中加不同浓度碘培养细胞48小时,与对照组相比,碘浓度为3506mg/L-4076mg/L时,细胞生长正常(P0.05);碘浓度为4647mg/L及以上浓度时,细胞生长受抑制(P0.05,P0.01),且抑制作用与培养液碘浓度呈正相关关系。 2细胞形态学观察 2.1瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态 细胞加碘培养48小时后,与对照组相比,碘浓度为3506mg/L-5218mg/L时,细胞密度无明显变化,形态无明显差异,细胞结构完整,呈典型的“铺路石”样分布;碘浓度为5789mg/L及以上浓度时,随着碘浓度增大,细胞密度降低,细胞形状不规则,出现“裸核”。 2.2吖啶橙染色观察细胞凋亡 细胞加碘培养48小时后,与对照组相比,碘浓度为3506mg/L-4647mg/L时,细胞密度无明显变化,细胞形态正常;碘浓度为5218mg/L及以上浓度时,随碘浓度增大,细胞密度逐渐降低,形态不规则,细胞核变形,荧光碎片增多。 3Annexin V-FICT/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率 细胞加碘培养48小时后,与对照组相比,碘浓度为4076mg/L及以上浓度时,细胞生存率显著降低(P0.01),且随着碘浓度增大,细胞生存率逐渐降低;碘浓度为4076mg/L时,细胞凋亡率显著升高(P0.01)。 4细胞培养液中SOD、GSH-px活性, MDA、GSH和蛋白质羰基含量 不同浓度碘作用于细胞48小时后,与对照组相比,碘浓度为4647mg/L及以上浓度时,SOD活性降低(P0.05或P0.01);碘浓度为3506mg/L及以上浓度时,GSH-Px活性下降(P0.05或P0.01);碘浓度为5789mg/L及以上浓度时,MDA含量增加(P0.05或P0.01);碘浓度为3506mg/L及以上浓度时,GSH含量降低、蛋白质羰基含量明显增加(P0.05或P0.01)。 5细胞培养液中NOS活性和NOS-mRNA的表达 5.1细胞培养液中NOS活性 细胞加碘培养48小时后,与对照组相比,碘浓度为5218mg/L及以上浓度时,eNOS活性下降(P0.05,P0.01);碘浓度为3506mg/L及以上浓度时,iNOS活性活性升高(P0.05,P0.01); 5.2细胞培养液中NOS-mRNA的表达 细胞加碘培养48小时后,与对照组相比,碘浓度为5218mg/L及以上浓度时,eNOS-mRNA表达量明显下降(P0.01);碘浓度为4076mg/L及以上浓度时,iNOS-mRNA表达量明显增强(P0.01)。 6.细胞粘附因子的表达 细胞加碘培养48小时后,与对照组相比,碘浓度为5789mg/L及以上浓度时,VCAM-1含量升高(p0.05,P0.01);碘浓度为4076mg/L及以上浓度时,ICAM-1含量下降(P0.05,P0.01)。 结论: 1.一定浓度范围内,高碘可抑制大鼠动脉内皮细胞增殖,并有剂量-效应关系; 2.高碘可改变动脉内皮细胞形态,并导致细胞凋亡; 3.高碘可致动脉内皮细胞抗氧化能力下降,降低细胞培养液SOD和GSH-Px活性,提高MDA和蛋白质羰基含量,降低GSH含量; 4.高碘可致抑制动脉内皮eNOS-mRNA表达,降低eNOS活性;刺激iNOS-mRNA表达,增强培养液中iNOS活性; 5.高碘可刺激动脉内皮细胞粘附因子表达,使培养液中ICAM-1和VCAM-1表达增强。 以上实验结果提示高碘对大鼠主动脉内皮细胞具有损伤作用,可能是动脉粥样硬化的形成机制之一。


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