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ILT4在非小细胞肺癌中的作用及分子机制研究

张沛  
【摘要】:研究背景肺癌的发病率和死亡率是全球恶性肿瘤的第一位,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌患者的80~85%,而且绝大部分初治病人处于进展期或已发生转移。因此,如何调节和控制肿瘤细胞侵袭转移对于NSCLC的治疗至关重要。肿瘤侵袭转移是多因素参与、多步骤完成的生物化学变化过程,其中肿瘤细胞增殖生存及侵袭迁移能力的增强、逃避免疫打击以及刺激肿瘤血管淋巴管生成等是肿瘤发生侵袭转移的关键环节。免疫球蛋白样转录子(immunoglobulin-like transcript, ILT)是近年来发现的一类免疫球蛋白超家族。ILT家族基因都定位于19号染色体相同的区域,主要在单核细胞、B细胞及树突状细胞(dendritic cell, DC)等细胞表达。根据其功能性质,ILT家族分为刺激性受体(ILT1, ILT6, ILT7 and ILT8)和抑制性受体(ILT2,ILT3, ILT4 and ILT5),其中抑制性受体胞质区含有免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)长胞质尾部,通过募集含SH2结构的酪氨酸磷酸激酶(SH2-containing protein tyrosine phos-phatase,SHP)-1和SHP-2将细胞外信号向细胞内传递的作用发挥生物学效应。研究发现,ILT家族成员在一些髓系肿瘤中高表达:ILT2可在T细胞淋巴瘤中高表达,且高表达的ILT2可以拮抗CD3单抗诱发的细胞死亡;ILT3及ILT4在慢性B淋巴细胞白血病中高表达,且ILT3高表达在伴有淋巴结浸润的患者中更常见。我们前期研究发现,ILT4在实体瘤NSCLC、乳腺癌、结肠癌组织及其相应肿瘤细胞株中表达,且ILT4高表达的肿瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltration lymphocytes, TILs)数量显著减少,发生淋巴结转移的几率明显增高。近期研究发现,ILT4及其小鼠同源性配对免疫球蛋白样受体(paired immunoglobulin-like-receptor, PIRB)在急性单核细胞白血病细胞中mRNA的水平明显升高;在小鼠移植AML模型中,缺失PIRB会导致白血病细胞分化;在胰腺癌细胞中,阻断ILT4后,细胞运动能力降低;揭示ILT4在促进肿瘤进展中发挥着重要的作用;然而ILT4在NSCLC发生进展中的作用及分子机制目前尚不清楚。研究目的为明确ILT4在NSCLC疾病进展中的作用,我们通过转染技术,过表达或干扰NSCLC细胞中的ILT4,检测ILT4对NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学表型的影响;进行表达谱基因芯片分析,进一步明确ILT4促进肿瘤进展的分子机制,为ILT4在NSCLC的治疗中的潜在价值提供理论基础。研究方法1.通过PCR及Western blot检测ILT4基因在NSCLC细胞株中的表达,筛选出高表达ILT4的细胞株和低表达ILT4的细胞株。选择ILT4表达低的细胞株H1650和H1975转染ILT4质粒上调ILT4表达,并通过慢病毒感染建立稳定过表达ILT4细胞株;选择ILT4高表达的细胞株A549和H226转染ILT4shRNA干扰ILT4表达,并通过慢病毒感染建立稳定干扰ILT4细胞株。2.通过生长曲线及平板克隆实验,检测ILT4对NSCLC细胞生长、增值的影响;通过Annexin V-FITC/PI流式细胞术,检测ILT4对NSCLC细胞凋亡的影响;通过Transwell小室侵袭迁移实验,检测ILT4对NSCLC细胞侵袭迁移能力的影响。3.通过慢病毒感染建立稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株ILT4/H1650及对照细胞株NC/H1650;稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株shILT4/A549及对照细胞株shNC/A549,选择BALB/c Nude裸鼠分别皮下注射上述细胞。观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响。4.通过慢病毒感染建立稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株ILT4/H1650及对照细胞株NC/H1650;稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株shILT4/A549及对照细胞株shNC/A549,选择BALB/c Nude裸鼠尾静脉注射细胞。观察ILT4对肿瘤细胞体内转移能力的影响。5.通过Western blot检测ILT4对基因MAPK通路相关靶蛋白ERK、p38MAPK及JNK的表达的影响,并筛选ILT4下游信号通路ERK信号通路;通过加入信号通路抑制剂阻断信号通路,观察ILT4过表达细胞株在抑制ERK信号通路后,对NSCLC细胞增殖及侵袭迁移的影响。6.通过表达谱基因芯片前期筛选,并进行PCR及Western blot验证,筛选检测ILT4对基因VEGF-C的表达的影响;并通过加入ERK信号通路抑制剂观察ILT4是否通过此信号通路调节VEGF-C的表达;通过加入siRNA阻断VEGF-C表达,观察ILT4过表达细胞株抑制VEGF-C表达后,对NSCLC细胞增殖及侵袭迁移的影响;7.利用免疫组织化学染色检测ILT4和VEGF-C在肿瘤组织及相应癌旁正常组织中的表达;根据免疫组化染色评分结果,统计分析ILT4和VEGF-C表达水平与NSCLC患者临床病理学特征之间的相关性;收集NSCLC患者的随访资料,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,应用log-rank检验分析ILT4和VEGF-C的表达与NSCLC患者生存时间之间的关系。8.通过表达谱基因芯片前期筛选,并通过PCR及Western blot验证,检测ILT4对共刺激分子B7-H3的表达及PI3K/AKT/mTOR信号通路激活的影响:通过加入P13K及mTOR信号通路抑制剂,观察ILT4是否通过此信号通路调节B7-H3的表达;9.利用免疫组织化学染色检测ILT4和B7-H3在NSCLC组织中的表达及其相关性,并分析ILT4及B7-H3表达水平与肿瘤TIL数量间的关系。研究结果1.ILT4促进NSCLC细胞增殖及侵袭迁移PCR及Western blot检测结果显示:ILT4在本实验中所用5株NSCLC细胞株(A549、H226、H1299、H1650及H1975)中均有表达,其中H1650及H1975表达最低,A549及H226表达最高。过表达ILT4表达后,H1650及H1975细胞增殖及侵袭迁移能力明显增强;干扰ILT4表达后,A549及H226细胞增殖及侵袭迁移能力明显受到抑制;然而,ILT4对NSCLC细胞的抗凋亡能力无明显影响。2.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及转移通过建立皮下移植模型发现ILT4对NSCLC细胞体内成瘤及瘤体生长均有显著的影响:过表达ILT4后,肿瘤生长速度显著快于其对照组,肿瘤组织重量大于其对照组;同样,干扰表达ILT4后,肿瘤生长速度显著慢于其对照组,肿瘤组织重量小于其对照组。通过建立尾静脉注射模型发现ILT4对NSCLC细胞体内转移亦有明显的影响:造模后6周取小鼠肺组织,计数表面肿瘤表面转移灶,并通过HE染色进行病理形态学观察。结果显示过表达ILT4后,裸鼠肺组织转移灶数目显著多于其对照组;干扰ILT4后,裸鼠肺组织转移灶数目小于其对照组。3.ILT4通过激活下游ERK信号通路促进NSCLC细胞恶性表型Western blot检测结果显示:过表达ILT4后,H1650及H1975细胞中ERK的磷酸化水平明显升高;而干扰ILT4后,A549及H226细胞中ERK的磷酸化水平明显降低;而无论过表达或干扰ILT4,对p38MAPK及JNK通路均无显著影响。此外,过表达ILT4的细胞株ILT4/H1650及ILT4/H1975,加入ERK信号通路抑制剂U0126后,细胞增殖及侵袭迁移能力明显受到抑制。4.ILT4通过上调下游作用分子VEGF-C促进NSCLC细胞恶性表型表达谱基因芯片结果显示:ILT4可促进多种生长因子表达上调。后续PCR及Western blot检测结果显示:H1650及H1975细胞过表达ILT4后,细胞中VEGF-C的表达水平明显升高;而干扰ILT4后,A549及H226细胞中VEGF-C的表达水平明显降低。在过表达ILT4的细胞株ILT4/H1650及ILT4/H1975中加入ERK信号通路抑制剂U0126后,VEGF-C的表达水平明显下降。内源性高表达ILT4的细胞株A549及H226转染siRNA抑制VEGF-C表达后,细胞增殖侵袭迁移能力明显受到抑制;在过表达ILT4的细胞株ILT4/H1650及ILT4/H1975中转染siRNA抑制VEGF-C表达后,细胞侵袭迁移能力明显受到抑制,而细胞增殖能力变化不明显。5.ILT4在原发性NSCLC组织肿瘤细胞中的表达与VEGF-C呈正相关免疫组化检测结果显示:在105例临床标本中,ILT4阳性表达率45.7%(48/105),并与高龄(p=0.044)、细胞低分化(p=0.038)、淋巴结转移(p=0.04)及TNM分期(p=0.013)呈正相关;高表达ILT4的患者5年生存率偏低(p=0.035);且ILT4与VEGF-C表达呈明显正相关p=0.024),ILT4和VEGF-C共表达的患者预后更差(p=0.009)。6.ILT4上调免疫共刺激分子B7-H3表达PCR及Western blot检测结果显示:过表达ILT4后,B7-H3表达水平明显升高;而干扰ILT4后,细胞B7-H3表达水平明显降低。此外,过表达ILT4后,AKT、mTOR、ERK的磷酸化水平升高;而干扰ILT4表达后,AKT、mTOR、 ERK的磷酸化水平降低。而且在过表达ILT4的NSCLC细胞株中分别加入P13K及mTOR信号通路抑制剂后,B7-H3表达水平明显下降;而加入ERK信号通路抑制剂U0126后,B7-H3表达水平无明显变化。7.ILT4在原发性NSCLC组织肿瘤细胞中的表达与B7-H3呈正相关免疫组化检测结果显示:在118例临床标本中,ILT4与B7-H3表达呈明显正相关(p=0.021),并且ILT4和B7-H3共表达的患者肿瘤组织中TILs数量明显减少(p=0.007),且预后较差(p=0.029)。结论1.体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC细胞增殖、侵袭及迁移等多种恶性生物学行为。2.ILT4可通过激活NSCLC细胞中的ERK信号通路上调VEGF-C表达,从而影响肿瘤恶性生物学行为,最终促进肿瘤进展。3.ILT4可通过激活NSCLC细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号通路上调免疫共刺激分子B7-H3的表达,参与肿瘤免疫逃逸,从而促进肿瘤进展。


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