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TLR4/PI3K信号通路在大鼠颞下颌关节滑膜炎中的作用研究

林雪芬  
【摘要】:第一部分TLR4对脂多糖诱导的大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响目的:研究Toll样受体-4 (Toll like receptors 4, TLR4)对脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导的大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、 TNF-α的影响,探讨TLR4在颞下颌关节病发病机制中的作用。方法:无菌条件下取大鼠颞下颌关节滑膜组织,采用酶消化法获取原代滑膜细胞进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,并采用免疫荧光细胞化学方法检测波形蛋白(vimentin)和CD68的表达。以终浓度为0,0.1,1,10,100 ng/mL的LPS刺激滑膜成纤维细胞24h,或以LPS(终浓度100ng/mL)刺激细胞0,1,6,12,24h,检测LPS刺激与IL-1β、TNF-α表达的量效和时效性关系,选择最佳的刺激浓度与时间。应用LPS刺激细胞,Western blot检测TLR4、MyD88的表达变化,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELIS A)检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达情况,应用Realtime PCR检测TLR4、 MyD88、IL-1β、TNF-αmRNA的表达变化。用TLR4的特异性抑制剂TAK-242预处理滑膜成纤维细胞后,再加入LPS刺激细胞,应用Realtime PCR检测IL-1β、 TNF-α mRNA的表达变化,采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达情况。结果:倒置显微镜下可见细胞呈梭形,细胞外形均匀一致,具有成纤维细胞的形态,所有培养的滑膜细胞均对CD68蛋白表达阴性,vimentin表达阳性。证实该细胞是滑膜成纤维细胞。经LPS刺激后,IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表达量升高,并且随着LPS刺激浓度的增加而逐渐升高。同时,呈现一定的时间依赖关系,IL-1β、TNF-α表达量在12h到达高峰,IL-1β、TNF-α mRNA在6h到达高峰。LPS能够明显增强TLR4、MyD88、IL-1β, TNF-amRNA及蛋白表达,TAK-242的应用能显著抑制LPS诱导的滑膜成纤维细胞IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达。结论:TLR4在LPS诱导的滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α过程中起到重要的调控作用,特异性抑制剂TAK-242可以有效地抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达。TLR4可能参与了颞下颌关节紊乱病的发生发展过程。第二部分TLR4在PI3K/Akt信号通路调节颞下颌关节滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α中的作用研究目的:探讨PI3K/Akt信号通路对颞下颌关节滑膜成纤维细胞IL-1β、TNF-α的表达调控过程,研究TLR4对PI3K/Akt信号通路调节SFs表达IL-1β、TNF-α的影响。方法:体外培养大鼠颞下颌关节滑膜细胞,应用LPS刺激细胞,Western blot检测PI3K、Akt、P-PI3K、P-Akt的表达变化,采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达情况,应用Realtime PCR检测IL-1β、TNF-αmRNA的表达变化。用Pi3K的特异性抑制剂LY294002预处理滑膜成纤维细胞后,再加入LPS刺激细胞,应用Real time PCR检测IL-1β、TNF-αmRNA的表达变化,采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达情况。用TLR4的特异性抑制剂TAK-242预处理滑膜成纤维细胞后,再加入LPS刺激细胞,Western blot检测P-Pi3K的表达变化。结果:经LPS刺激后,与对照组相比,P-PI3K、P-Akt、IL-1β、TNF-α的表达量显著升高。LY294002的应用能显著抑制LPS诱导的滑膜成纤维细胞IL-1β、 TNF-α mRNA及蛋白的表达。TAK-242的应用能显著抑制LPS诱导的滑膜成纤维细胞P-PI3K的表达。结论:PI3K/Akt信号通路在颞下颌关节滑膜成纤维细胞IL-1β、TNF-α的表达调控过程中起着重要作用。特异性抑制剂LY294002可以有效地抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达。TLR4对PI3K/Akt信号通路调节SFs表达IL-1β、TNF-α有着重要作用。PI3K/Akt信号通路可能参与了颞下颌关节紊乱病的发生发展过程。第三部分TLR4在调节大鼠颞下颌关节滑膜炎症反应中的作用目的:研究TLR4在调节大鼠颞下颌关节滑膜炎症反应中的作用,探讨TLR4在颞下颌关节病发病机制中的作用。方法:采用四种方法建立颞下颌关节滑膜炎动物模型,咬肌切除组:切除大鼠双侧咬肌;咬合干扰组:右下第一磨牙粘接铸造金属冠;咬合升高组:粘接上颌磨牙牙合垫;咬肌切除加咬合升高组:切除双侧咬肌并粘接上颌磨牙牙合垫。通过观察大鼠滑膜组织的病理学改变选择一种稳定而有效的建模方法。建立大鼠颞下颌关节滑膜炎模型后,免疫组织化学染色检测滑膜组织中TLR4.MyD88.IL-1p. TNF-α的表达变化,应用Realtime PCR检测滑膜组织中TLR4、MyD88.IL-1β、 TNF-αmRNA的表达变化。在大鼠双侧颞下颌关节腔内注射TLR4的特异性抑制剂TAK-242,应用HE染色观察滑膜组织的炎症反应。免疫组织化学染色检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α的表达变化,应用Realtime PCR检测滑膜组织中IL-1β、 TNF-αmRNA的表达变化。结果:HE染色图片显示咬肌切除加咬合升高组出现明显的炎症反应,其病理学评分与其他三个实验组相比有显著差异。采用切除双侧咬肌并粘接上颌磨牙牙合垫的方法建立滑膜炎模型,模型组滑膜组织出现TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA的表达升高。TAK-242的应用可以缓解滑膜组织的炎症反应,并且使IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA的相对表达量显著下降。结论:TLR4在大鼠颞下颌关节滑膜炎症反应中起到重要的调控作用,特异性抑制剂TAK-242可以有效地抑制滑膜炎发病过程中出现的IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白的表达。TLR4可能参与了颞下颌关节紊乱病的发生发展过程。第四部分TLR4在PI3K/Akt信号通路调节大鼠颞下颌关节滑膜炎症反应中的作用目的:探讨PI3K/Akt信号通路在调节颞下颌关节滑膜炎中的作用,研究TLR4在PI3K/Akt信号通路调节颞下颌关节滑膜炎症反应过程中的作用及意义。方法:采用切除双侧咬肌并粘接上颌磨牙牙合垫的方法建立滑膜炎模型,免疫组织化学染色检测滑膜组织中P-PI3K、P-Akt、IL-1β、TNF-α的表达变化,在大鼠双侧颞下颌关节腔内注射Pi3K的特异性抑制剂LY294002,应用HE染色观察滑膜组织的炎症反应变化。免疫组织化学染色检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α的表达变化,应用Realtime PCR检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α mRNA的表达变化。在大鼠双侧颞下颌关节腔内注射TLR4的特异性抑制剂TAK-242,免疫组织化学染色检测滑膜组织中P-PI3K的表达变化。结果:采用切除双侧咬肌并粘接上颌磨牙牙合垫的方法建立滑膜炎模型,模型组滑膜组织出现P-PI3K、P-Akt蛋白表达升高。LY294002的应用可以缓解滑膜组织的炎症反应,并且使IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA的相对表达量显著下降。TAK-242的应用能显著抑制滑膜组织P-Pi3K的表达。结论:PI3K/Akt信号通路在调控大鼠颞下颌关节滑膜炎症过程中起重要作用。特异性抑制剂LY294002可以有效地抑制切除双侧咬肌并粘接上颌磨牙牙合垫诱导的颞下颌关节滑膜炎症反应,并且抑制滑膜组织IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白的表达。PI3K/Akt信号通路可能参与了颞下颌关节紊乱病的发生发展过程。TLR4在PI3K/Akt信号通路调节颞下颌关节滑膜炎症反应过程有着重要作用。


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