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Metadherin通过Wnt/β-catenin及BCR通路参与慢性淋巴细胞白血病的发病机制

李沛沛  
【摘要】:慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是欧美国家老年人群中发病率最高的血液系统疾病,约占所有成人淋巴瘤患者总数的1/3,据美国癌症协会估计每年慢性淋巴细胞白血病新发患者可能达到15680人。CLL预后个体差异很大,与该疾病的分期关系并不十分显著。近年来,氟达拉滨、环磷酰胺联合美罗华(Fludarabin + Cyclophosphamide + Rituximab, FCR)的治疗方案在CLL患者中取得了较好效果。该化学免疫治疗方案明显改善了患者的预后,提高了患者的完全缓解率和长期生存率。即便如此,目前仍有50%的初治CLL患者在FCR诱导下无法达到完全缓解。对于复发,携带不良预后因子的CLL患者的治疗方案的选择仍是目前研究的重点。近年来随着基因表达谱的分析应用增进了对CLL发病机制的了解,发现了大量参与CLL发生发展的癌基因及调节异常的信号分子。它们导致多条信号通路调节异常进而实现其促瘤机制,如B细胞受体(B cell receptor, BCR), Nuclear factor (NF)-κB, NOTCH和 Wnt/β-catenin信号通路等。靶向抑制这些信号通路中的重要分子可以对CLL起到治疗作用。CLL是一个高度异质性的疾病,关于CLL的发病机制目前仍有许多未知领域等待我们去发现。Metadherin (MTDH)最初在肿瘤坏死因子-α和人免疫缺陷病毒感染(Human immunodeficiency virus-1, HIV-1)后的星状细胞中被发现。MTDH与肿瘤相关的证据首先在多种肿瘤细胞株中获得,同期实验表明其参与鼠类乳腺癌肺转移。其后研究表明MTDH几乎表达于所有人类的肿瘤细胞中,参与肿瘤细胞的增殖,生存和转移活性。作为促进肿瘤发生发展的关键因子,MTDH在多种肿瘤中被证实是可以用于判断预后的癌基因。MTDH的促肿瘤作用部分通过对信号通路的调节实现,如Wnt, Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT,NF-κB,mitogen-activated protein kinases (MAPK)信号通路等。Wnt信号通路在胚胎发育、神经再生、机体内稳态和肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。Wnt信号有三条下传途径,其中经典的Wnt/β-catenin信号通路(canonical Wnt/β-catenin pathway)与肿瘤关系较为密切。Wnt通路的调节异常被证实与胃癌、前列腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、甲状腺癌、卵巢癌、皮肤癌、子宫内膜癌、乳腺癌等等肿瘤的发生发展有关。Wnt/β-catenin信号通路参与多种非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma, NHL)的发生发展,如套细胞淋巴瘤、结外边缘区淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、和弥漫大B细胞淋巴瘤等。在CLL中,Wnt家族蛋白及相关蛋白异常高表达,如Wnt3、Wnt5b、Wnt6和LEF-1等。抑制Wnt信号通路活性可以减低CLL细胞的生存活性,起到治疗作用。细胞微环境在CLL的发生发展过程中扮演重要角色。微环境中的信号分子介导了CLL细胞的增殖和抗凋亡活性,并参于了细胞的耐药。抑制这些信号通路是传统的化学免疫治疗方案之外的另一治疗选择。BCR信号通路是CLL中一个非常重要的信号通路,针对BCR信号通路信号分子SYK, BTK和PI3Kδ的抑制剂如fostamatinib,ibrutinib和idelalisib在CLL治疗中取得较好疗效。对B细胞受体功能的研究有助于深入理解CLL的发病机制并发现新的治疗靶点。在此我们也进一步探讨了CLL中MTDH高表达与BCR信号通路间的关系。第一部分Metadherin在慢性淋巴细胞白血病中的表达及临床意义目的:MTDH是近几年克隆出来的新基因。MTDH促进肿瘤细胞的增殖活性,并参与肿瘤的侵袭和转移,与肿瘤恶性程度相关。MTDH的促肿瘤作用通过对信号通路的调节来实现,女Wnt/β-catenin、NF-KB和PI3K/AKT信号通路。目前尚无关于MTDH在CLL中的表达情况的相关研究。我们检测CLL患者和正常人不同组织来源的B细胞中MTDH的表达差异,并与患者的临床特征进行相关性分析,初步评估MTDH是否参与了CLL的发病。研究方法:1、标本收集;2、密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,免疫磁珠阳选法分离B细胞。使用流式细胞术对B细胞纯度进行鉴定;3、Trizol法提取RNA并行定量RT-PCR检测;4、蛋白提取及蛋白印迹分析;5、流式细胞术检测MTDH表达;6、统计学分析。结果:1、CLL细胞株MEC-1中MTDH表达阳性;2、MTDH在CLL患者mRNA水平表达增高并与患者的临床分级相关;我们实验中所用的B细胞纯度均在90%以上。在31例CLL患者的B细胞中MTDH在mRNA水平的表达明显高于15例年龄相关的正常人外周血B细胞(P0.0001)。根据Rai临床分期判断,从I到IV期患者B细胞中MTDH的mRNA的表达水平逐渐增高,但III期与IV患者之间并没有显著统计学差异。β2-MG(P=0.002)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH,P=0.004)高表达的患者中MTDH表达水平要高于两者的检测值在正常范围内的患者。MTDH表达与CLL患者年龄(P=0.378)与性别(P=0.223)无关。3、MTDH在蛋白质水平表达增高;在31例CLL患者中有27例患者的MTDH表达阳性,而在年龄相关的15例正常人外周血单个核中未检测到MTDH的表达。(P0.0001)考虑到B细胞在两者之间的纯度差异,实验进一步用流式细胞学方法检测MTDH在CLL患者B细胞与正常人不同组织来源B细胞中的表达差异情况。在CLL患者MTDH+细胞比例介于94.3%到97.5%之间。外周血、脐血、骨髓、扁桃体及中MTDH+细胞所占的比例分别为12.49%,2.13%,2.70%,和6.66%。结论:1、MTDH在CLL患者B细胞及CLL细胞株中表达增高,在CLL患者中MTDH阳性率达87%,考虑其可能作为癌基因在CLL中发挥促瘤作用;2、MTDH在mRNA水平上表达的增高与CLL的临床分期及血清学预后指标β2-MG和LDH相关,与患者的性别、年龄等无相关关系;3、因为TP53及IGVH基因重排的患者病例数过少,本实验中我们未对其与MTDH表达的关系进行统计学分析。CLL的预后与这些异常表达的基因及核型密切相关,这也是我们今后对MTDH在CLL发病机制中的作用的研究方向之一。第二部分Metadherin表达变化对慢性淋巴细胞白血病生物学行为的影响目的:MTDH在多种肿瘤中高表达,并参与肿瘤的增殖、转移、耐药等恶性生物学过程。在多种肿瘤中的研究结果表明,抑制MTDH的表达可以抑制肿瘤细胞活性。前面我们证实MTDH在CLL中高表达,在此,我们应用CLL细胞株MEC-1为研究对象,使用慢病毒转染细胞介导MTDH的基因沉默,进一步研究MTDH表达变化对MEC-1生物学行为的影响。为寻求CLL治疗的新靶点提供理论依据。材料方法:1、细胞培养;2、慢病毒转染介导的RNAi靶向沉默慢性淋巴细胞白血病的MTDH基因;3、免疫荧光显微镜,流式检测细胞转染效率;4、提取RNA,进行实时定量RT-PCR;5、蛋白提取及蛋白印记分析;6、CCK-8法检测细胞增殖;7、Annexin V-PE/7-AAD双染测凋亡;8、统计学分析。结果:1.荧光显微镜观察GFP荧光强度,流式细胞术鉴定GFP阳性细胞所占比率,结果表明在MEC-1中病毒转染效率约为60%-70%;2、在mRNA和蛋白质水平检测在MEC-1细胞中MTDH基因的干扰情况;3、MTDH干扰后细胞的凋亡增加约17%(6.550±1.518 vs 23.79±3.753),增殖抑制约45%(106±14.08 vs 60.55±8.321)。结论:1、MTDH参与CLL的促增殖及抗凋亡作用;2、MTDH是CLL的潜在治疗靶点;3、探讨MTDH对CLL信号通路的调节有助于阐明CLL的发病机制。第三部分Metadherin参与慢性淋巴细胞白血病中Wnt/β-catenin信号通路的调节目的:MTDH参与多条信号通路的调节作用,其对Wnt信号的调节作用在肝癌、胃癌和DLBCL中已被阐明。在CLL中,Wnt信号通路异常活化。通过抑制Wnt信号可以对CLL起到治疗作用。在这部分我们试图探讨MTDH在CLL中与Wnt/β-catenin信号通路的相关关系。研究方法:1、细胞培养;2、慢病毒转染介导的RNAi靶向沉默慢性淋巴细胞白血病的MTDH基因;3、免疫荧光显微镜,流式检测细胞转染效率;4、提取RNA,进行实时定量RT-PCR;5、蛋白提取及蛋白印记分析;6、统计学分析。结果:1、MTDI干扰使细胞株MEC-1中Wnt信号通路信号分子表达下调;慢病毒载体介导的MTDH基因沉默使MEC-1中LEF-1表达减低,同时伴有cyclinD1及c-myc基因nRNA水平的表达减低,但对β-catenin无明显影响。2、CLL患者原代细胞中MTDH与LEF-1表达正相关;在14例CLL患者中同时进行MTDH与LEF-1的表达检测,统计学数据表明两者间存在正相关关系r=0.879,P0.01。在正常人PBMC中两者表达均为阴性。结论:1、MTDH对CLL的生物学行为的影响部分通过Wnt信号通路实现;2、MTDH是CLL的潜在治疗靶点;3、该部分对MTDH对Wnt通路的影响进行了初步探讨,其确切机制还有待于进一步研究。第四部分MTDH参与CLL中BCR信号通路的调节目的:CLL微环境对CLL意义重大,BCR通路是其研究的重点。BCR通路和MTDH均参与了Ras和PI3K/AKT通路的调节,但其间关系并不明确。在此我们试图探讨BCR信号通路活化与MTDH表达之间的调节关系。材料方法:1、标本收集;2、CLL原代细胞与细胞株培养3、BCR活化实验4、慢病毒转染介导的RNAi靶向沉默慢性淋巴细胞白血病的MTDH基因5、免疫荧光显微镜,流式检测细胞转染效率;6、提取RNA,进行实时定量RT-PCR;7、蛋白提取及蛋白印记分析;8、统计学分析。结果:1、BCR信号活化促进CLL原代细胞的增殖;研究表明携带有umIgVH,CD38及ZAP-70表达的CLL患者的细胞倾向于在anti-IgM抗体刺激下发生增殖,其中μm-IgVH的指向性更为明确。考虑到这种差异,我们的研究选取了6名携带um-IgVH,并且其B细胞进行体外anti-IgM抗体刺激下细胞发生增殖的患者。2、BCR活化过程伴随着MTDH的表达上调;3、MTDH参与MEC-1细胞株中BCR的活化;MEC-1细胞株携带有um-IgVH,并-1且anti-IgM抗体刺激可使细胞增殖增加约1.3倍。干扰MTDH在MEC-1中的表达可以阻断BCR活化介导的MEC-1的增殖反应。结论:1、CLL中,BCR信号通路的活化可以介导MTDH的表达;2、阻断MTDH表达干扰了BCR信号活化所介导的CLL细胞的增殖;3、MTDH是CLL的潜在治疗靶点,其治疗作用部分通过阻断BCR信号传导而实现;4、进一步研究MTDH在um-IgVH和m-IgVH患者中的不同功能有助于我们进一步了解MTDH与BCR信号通路的关系。意义:我们的研究结果首次证实MTDH在CLL的B细胞中异常表达,并与CLL患者的临床分级及血清学预后指标β 2-MG和LDH相关。在CLL中,87%的患者存在MTDH的高表达,而正常人不同组织来源的B细胞中无表达,这提示我们MTDH可能作为原癌基因参与CLL的发生发展。干扰MTDH表达导致CLL细胞增殖受抑,凋亡增加。该作用部分通过阻断MTDH对Wnnt信号和BCR信号的进一步增强来实现。这提示我们MTDH是CLL的一个潜在的治疗靶点。因为病例数较少,我们并没有对它与其它临床预后指标如TP53,IGVH重排的关系进行研究,对于MTDH在CLL中对Wnnt和BCR信号通路的具体调节机制尚不明确。MTDH在多数患者中有表达,这也提示我们需要进一步了解在m-IgVH的CLL患者中MTDH与BCR信号的关系。这是我们今后研究的方向。


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